Introdução
As membranas celulares apresentam uma função ímpar na manutenção da integridade celular, como também na regulação da permeabilidade das membranas. As membranas são constituídas de proteínas e lipídios, organizados em bicamadas assimétricas, conforme modelo proposto em 1972 por Singer & Nicolson (Figura 1).
Figura 1: Modelo de mosaico fluído para membranas biológicas. Fonte: http://4.bp.blogspot.com/-LMBjKTJ0aU4/ThC01DaKpZI/AAAAAAAAAQk/DknJFU-X0hs/s1600/mosaico+fluido.jpg
Uma das principais funções das membranas é regular a permeabilidade diferencial, isto é, todas elas são capazes de controlar o fluxo de nutrientes e de água para dentro ou para fora dos compartimentos que estão delimitando.
Pigmentos vermelhos e púrpuras da classe das betacianinas são encontrados nas raízes de beterraba (Beta vulgaris), pigmentos estes que caracterizam o gênero Beta sp. Estes pigmentos são estocados nos vacúolos e a membrana tonoplastídica os protege do meio externo. Em situação normal estes pigmentos não conseguem ultrapassar através das membranas plasmáticas, mas podem ultrapassar pela parede celular. Entretanto, se a membrana plasmática sofrer algum tipo de dano físico ou químico a permeabilidade é perdida, podendo haver extravasamento de pigmentos.
Thomashow (1999), descreveu que as membranas plasmáticas poderiam sofrer diferentes arranjos quando submetidas à diferentes temperaturas, onde temperaturas baixas e altas alteravam a estrutura das membranas tornando-as mais permeáveis ou mais rígidas (Figura 2). Dessa forma, nesta aula verificaremos como diferentes temperaturas afetam a estrutura e a permeabilidade da membrana tonoplastídica.
Figura 02 Efeito da temperatura na permeabilidade da membrana
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Objetivos específicos dessa prática
Avaliar a permeabilidade das membranas plasmáticas e vacuolares em tecidos de raízes de beterraba;
Avaliar os efeitos de diferentes temperaturas sobre a permeabilidade das membranas celulares.
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Procedimentos
Figura 3 Preparação dos discos para os tratamentos
Com o auxílio de um fatiador de legumes, deve-se retirar discos de raiz de beterrada com espessura padrão de 5 mm. Na sequência, se deve retirar discos de 12 mm. Os discos devem apresentar coloração homogênea (Figura 3).
Figura 4 Coleta dos discos antes (A) e depois (B) da lavagem com água destilad
Todos os discos devem ser coletados diretamente num béquer contendo água destilada (Figura 4a). Em seguida deve-se lavar os discos em água destilada até que não se perceba mais pigmentos dissolvidos (Figura 4b).
Enxugue levemente os discos de beterraba, sem friccioná-los contra o papel para não danificá-los (Figura 5)
Figura 5 Processo sequencial para a coleta e breve secagem dos discos de beterraba
Figura 6 Preparo dos tubos teste com os discos
Introduza cinco discos homogêneos em cada um dos tubos de ensaio identificados como: (i) temperatura ambiente de 25ºC (bancada), (ii) temperatura congelante de -15 a -18ºC (freezer), (iii) temperatura refrigerante de 3 a 5ºC (geladeira), (iv) temperaturas elevadas de 50 a 60ºC (banho-maria) (Figura 6)
Figura 7 Inserir 10 mL de água destilada em cada tubo. Observação: Esse processo deve ser realizado o mais rápido possível
Todos os cilindros permanecerão em suas devidas temperaturas por cerca de 1 hora. Passado o tempo estipulado, introduza em cada tubo de ensaio 10 mL de água deionizada.
Agite vigorosamente os tudos e transfira o conteúdo para cubetas de acrílico e leia as respectivas absorbâncias em espectrofotômetro ajustado para 525 nm (Figura 8).
Figura 8 Coleta do material de lixiviação dos tubos nas diferentes temperaturas e (A) leitura em espectrofotômetro ajustado para 525 nm (B).
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Resultados esperados
Nesta prática, verificamos que a temperatura tem um efeito diferencial sobre a permeabilidade das membranas. Em temperaturas elevadas existe mudança na estrutura das proteínas que integram a membrana plasmática, permitindo que as sustâncias contidas no interior das células extravasem. O resultado deste processo mostra a coloração vermelha nas amostras. Em temperaturas baixas, os ácidos graxos dos fosfolipídios se tornam mais rígidos, diminuindo a fluidez e tornando as membranas menos permeáveis. Entretanto, com o congelamento, a água de solvatação das membranas congela com formação de cristais de gelo. Se os tecidos congelados forem bruscamente descongelados estes cristais de gelo de expandem muito rapidamente provocando danos nas membranas e o extravasamento do seu conteúdo (Figura 9).
Para se perceber o efeito desidratador sobre as membranas, pode-se fazer um outro teste, inserindo em um dos tubos, álcool comercial, fato que também eleva o extravasamento de pigmentos, sem necessariamente causar dados as membranas.
Figura 9 Resultado do ensaio para avaliar o efeito da temperatura sobre a permeabilidade das membranas celulares. Dados representados pela média e erro padrão (n = 3).
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Leitura complementar
Singer SJ, Nicolson GL (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175, 720-731.
Thomashow MF (1999) Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 50, 571-599.
