Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 45 – SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS ATRAVÉS DE ELETROFORESE EM GEL SDS-PAGE E COLORAÇÃO COM AZUL DE COOMASSIE

Introdução

A eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (dodecil-sulfato de sódio- polyacrylamide gel electrophoresis) permite a separação de misturas complexas como o extrato protéico. Apesar do desenvolvimento de métodos de extração cada vez mais eficientes em termos de limpeza e qualidade da amostra, a eletroforese possibilita que as proteínas obtidas sejam separadas em frações simples de proteínas para verificação da integridade e/ou identificação. O sistema SDS-PAGE consiste em um tipo de eletroforese em que as amostras são desnaturadas pelo calor na presença de β-mercaptoetanol, que desnatura pontes dissulfeto, e pelo SDS, o qual atua na separação das cadeias polipeptídicas isoladas e mantém as proteínas com saturação de cargas elétricas negativas. A velocidade de migração de uma proteína depende da intensidade do campo, da carga líquida da proteína, forma, tamanho, força iônica, da viscosidade e temperatura do meio. Finalizada a etapa de eletreforese o gel SDS-PAGE é submetido ao processo de coloração que consiste em tornar visível apenas as bandas proteicas coradas em azul de Coomassie contrastando com o gel transparente. Uma boa preparação da amostra, ou seja, a extração do máximo número de proteínas de um dado tecido ou órgão vegetal, e a subsequente separação e resolução são etapas cruciais para verificação da integridade e para posterior identificação dessas proteínas.


Objetivos específicos desta prática

Submeter o extrato protéico a eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 1D) ;

Revelar as proteínas utilizando a coloração com azul de Coomassie e detectá-las nos géis;

Determinar a massa molecular relativa de proteínas;

Verificar a eficiência da extração de proteínas através da visualização de bandas eletroforéticas íntegras nos géis.


Procedimentos

Preparo de gel SDS-PAGE e corrida eletroforética

Inicialmente, deve-se limpar cuidadosamente com etanol 70% todos os componentes do sistema de eletroforese que irão estar em contato com o gel de poliacrilamida (vidros, separadores, entre outros) (Figura 1).

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Figura 1. Componentes do sistema de eletroforese vertical como cuba, placas, pentes e cabos

Para o preparo de um mini-gel 12,5% nas dimensões 10 x 10 cm, deve-se proceder à montagem do suporte do gel e, preparar as soluções do gel de baixo (corrida/resolução) e do gel de cima (empilhamento/empacotamento) de acordo com a Tabela 1(suplemento), adicionando todos os componentes exceto o persulfato de amônio. Este só deverá ser adicionado imediatamente antes da aplicação do gel entre as placas de vidro (Figura 2).

fig_2-2

Figura 2. Visualização dos géis de empilhamento e de corrida

Adicionar o persulfato de amônio ao gel de corrida e homogeneizar cuidadosamente. Pipetar esta mistura, de imediato entre as placas de vidro, até cerca de 1 cm do limite superior dos vidros.

Colocar uma camada de 1 mL de isopropanol de forma a obter uma superfície plana. Deixar polimerizar. Após a polimerização, remover o isopropanol com papel absorvente. Preencher o volume com gel de empilhamento, evitando a retenção/formação de bolhas de ar e, então, introduzir o pente. Aguardar que o gel polimerize.

fig_3-2

Figura 3. Aplicação das amostras nos poços com auxílio de pipeta

Após a polimerização do gel aplicar as amostras (Figura 3) previamente dosadas na seguinte ordem:

Poço 1- Marcador de peso molecular

Poço 2- 50 µg do extrato proteico de folhas jovens

Poço 3- 10 µg do extrato proteico de folhas jovens

Poço 4- 50 µg do extrato proteico de raízes maduras

Poço 5- 10 µg do extrato proteico de raízes maduras


Proceder à montagem do sistema de eletroforese (Figura 4), colocando o tampão de corrida de eletroforese Tris-glicina (1x), tampando a cuba e ligando à fonte (150 V).

fig_4-1

Figura 4. Sistema de eletroforese unidimensional para corrida de gel SDS-PAGE


Coloração do gel SDS-PAGE

Para a visualização das bandas nos géis de poliacrilamida, deve-se proceder a etapa de coloração das proteínas. Inicialmente, remover os géis das placas após a eletroforese e colocar em placa de petri limpa (Figura 5a). Em seguida, cobrir o gel com solução de fixação e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos sob agitação leve (Figura 5b). Esta etapa exige cuidado para evitar a quebra do gel.

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Figura 5. Fixação do gel. A- Adicionar solução de fixação até cobrir o gel completamente e B- Incubar em agitação leve por 30 min a temperatura ambiente.

Remover a solução de fixação e em seguida adicionar solução corante com azul de Coomassie até cobrir completamente o gel e deixar corando por no mínimo 16 h (Figura 6a e 6b). Após este período remover a solução corante e adicionar a solução descorante que irá remover o comassie da área do gel em que não há bandas (Figura 6d e 6d). Esta ultima solução deve ser trocada a cada 1h até que as bandas se tornem nítidas. Por fim armazenar o gel em solução de preservação (Figura 7).

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Figura 6. Etapas de coloração. A- Adição da solução corante; B Agitação leve; C- Após remoção da solução corante, adição da solução descorante e D- Agitação leve com solução descorante


Resultados esperados

Após a obtenção dos géis, os alunos devem discutir sobre os resultados obtidos observando aspectos como qualidade da amostra em relação ao tecido e estádio de desenvolvimento. Além disso, características das bandas obtidas como peso e altura.

Em relação ao tecido será possível observar que em baixas concentrações (10 µg) as amostras tendem a apresentar um padrão de bandas semelhante entre as amostras, não refletindo a qualidade do tecido utilizado para a obtenção do extrato proteico. Em uma concentração mediana (50 µg) será possível observar que o uso de folhas gera uma padrão de bandas definido uma vez que este tecido não sofre grande degradação por estar distante da superfície. As raízes, por sua vez, em contato direto com o solo, apresentam tecidos degradados, ou seja, proteínas degradadas que irão influenciar negativamente no padrão de bandas. Além disso a idade do tecido irá contribuir para um perfil proteico bastante fiel as características de cada material usado. As folhas e raízes jovens apresentam um padrão claro, limpo e definido; as folhas maduras apresentam grande quantidade de pigmentos fotossintéticos gerando bandas com pouca definição, mas ainda limpas e, por fim, o padrão de raízes maduras que devido a alta concentração de proteínas degradadas apresenta um perfil proteico com pouca definição de bandas em relação as demais amostras.

Nesta prática, é possível ainda discutir quanto ao peso molecular das bandas obtidas quando comparadas com o padrão utilizado no gel. É possível observar que as bandas mais “pesadas”, devido ao maior tamanho, permanecem da parte superior do gel enquanto que as bandas menores são capazes de percorrer todo o gel e se posicionam na parte inferior (Figura 7).

fig_7

Figura 7. Esquema de um gel após corrida eletroforética e coloração

Tabela 1. Volumes dos reagentes e soluções para o preparo de um Mini-gel 12,5% (10 x 10 cm).Tabela 1 (1).jpg

Tabela 2. Reagentes necessários no preparo dos géis de eletroforese e coloração e descoloração dos géisTabela 2 (1).jpg

Tabela 3. Protocolo utilizado para soluções tampãoTabela 3 (1).jpg

Tabela 4. Protocolo utilizado para soluções estoque

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A figura 8 apresenta um esquema didático de fácil visualização do processo com um todo.

Fig_8.jpg

Figura 8. Esquema resumitivo do processo de extração de proteínas totais de plantas. 1- Coleta do material vegetal; 2- Pesagem em balança analítica; 3- Maceração em Nitrogênio líquido; 4- Adição do tampão de extração (TCA); 5- Transferência do macerado para tubos de 1,5mL; 6-Aspecto geral da amostra; 7- Vortexação da amostra; 8-Cetrifugação; 9-Descarte do sobrenadante; 10-Lavagem do pellet em acetoa 80% e 11- Aspecto do perfil proteico em gel SDS 12,5%


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