Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 12 – ESPECTROSCOPIA DE LUZ VISÍVEL E DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE DE EXTINÇÃO MOLAR

Introdução

O coeficiente de extinção molar, também conhecido como absortividade molar ou absorvidade molar, pode ser definido como a capacidade que um mol de uma determinada substância possui em absorver luz a um determinado comprimento de onda. A absortividade molar vai variar de acordo com diversos fatores, tais como a substância em questão e o comprimento de onda utilizado, bem como a temperatura e o solvente nos quais a substância se encontra. Portanto, pode-se dizer que o coeficiente de extinção molar é uma propriedade intrínseca das substâncias. Assim, segundo a Lei de Lambert-Beer, a absorbância (A) de uma amostra depende do comprimento de onda (L) e da concentração (C) da substância. Com isso, tem-se a seguinte fórmula:

2

Dentre os aparelhos de espectrofotometria utilizados atualmente, a maioria apresenta o comprimento de onda em função da absorbância. A absorbância, ou “densidade óptica”, representada por A, é dada pela seguinte equação: 

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onde I0 representa a intensidade da luz incidente e I é a intensidade da luz transmitida (Fig. 1).

Fig_1

Figura 1: Esquema demonstrando o funcionamento básico de um espectrofotômetro

 

Essa prática tem carácter muito mais investigativo do que acadêmico. O fato dos alunos serem estimulados a desvendar a natureza dos pigmentos que estão sendo utilizados na aula pode abrir caminhos para que estes alunos, no futuro, se interessem pelas áreas médicas pericial/criminal, área farmacêutica ou área agrícola, com a descoberta de novos fármacos e herbicidas. Nesta aula os alunos receberão inúmeras dicas para que, ao final da aula, consigam desvendar a natureza química dos diferentes pigmentos usados corriqueiramente na biologia.


Objetivos específicos desta prática

Determinar o espectro de absorção de diferentes substâncias de natureza desconhecida e calcular seus coeficientes de extinção molar;

A partir de soluções desconhecidas encontrar sua natureza química e suas principais características de forma a fornecer ferramentas de pesquisa de novas substâncias ou fármacos.


Procedimentos e Resultados Esperados

Antes de qualquer coisa, precisamos confirmar a natureza hidrofílica de cada uma das substâncias apresentadas pelo professor. Portanto, a partir das soluções corantes cedidas pelo professor, dilua-as nas proporções indicadas na tabela abaixo.

Tabela 1. Diluições recomendadas para as substâncias a serem utilizadas

tabela_1


Fig_2

Figura 2. Demonstrativo de cada um dos corantes em série antes da diluição em água. Da esquerda para a direita temos verde de metila, vermelho de cresol, azul de toluidina, safranina, iodo ressublimado e violeta cristal

Fig_3

Figura 3. Passos sequenciais de diluição em água do azul de toluidina. Verificar em D que a solução a esquerda é a original e a solução da direita é a solução diluída em água

Se todos os corantes foram bem diluídos e não houver formação de duas fases, pode-se dizer então que todos os corantes têm natureza hidrofílica, fato muito importante que deve ser anotado no caderno de laboratório (Figura 2 e Figura 3).


Fig_4

Figura 4. Processo de diluição do azul de toluidina diretamente na cubeta a inserção no espectrofotômetro para leitura

Fig_5

Figura 5: Espectro de absorção do azul de toluidina. Perceber que o pico máximo de absorção de luz pelo corante foi em 640nm.

De posse da solução diluída, encha uma cubeta com essa solução e uma outra cubeta com água destilada, introduzindo ambas no carrossel do espectrofotômetro e faça uma varredura no espectro, utilizando-se de comprimentos de onda de 320 nm a 800 nm com intervalos de 20 nm (320, 340, 360 … 800 nm).


Após conhecermos o comprimento de onda no qual a substância melhor absorve a luz, vamos tentar descobrir o coeficiente de extinção molar de cada uma das substâncias. Para tanto, vamos preparar uma sequencia de sete diluições da concentração inicial para fazer uma curva de calibração. Ao preparar cada uma das baterias de diluições, leia as absorbâncias e complete o quadro a seguir.

Tabela 2. Exemplo para preparação das diluições para cálculo do coeficiente de extinção molar das substâncias utilizadas.

tabela_2

Fig_6

Figura 6: Diluição em série dos corantes sugeridos para esta aula prática. A. Azul de toulidina, B. Iodo ressublimado, C. Violeta cristal, D. Safranina.

Agora que temos os valores médios de absorbância de cada uma das substâncias utilizadas podemos então calcular o coeficiente de extinção molar.

Antes disso temos que nos certificar que as diluições foram produzidas com bastante rigor. Para tanto, vamos utilizar o Microsoft® Excel para montar um gráfico no estilo dispersão de pontos, tendo como eixo X as concentrações em molaridade e no eixo Y para a média das absorbâncias registradas em cada concentração. Feito isso solicite que o Excel mostre a linha de tendência sobre os pontos da reta e apresente a equação da reta e o R2. Com isso teremos um gráfico semelhante ao mostrado na Fig. 7.

Fig_7

Figura 7: Representação gráfica dos valores de absorbância e da concentração da substância pesquisada. Verifique que o gráfico está com concentração dada em milimol L-1.


Caso você não saiba como calcular a molaridade de cada uma das concentrações veja o exemplo a seguir:

Partindo do azul de toluidina temos:

Pico de absorção máxima = 640 nm

Peso molecular da substância = 305,83 g L-1

Concentração estoque = 0,05 g L-1

Concentração após primeira diluição (7,5 mL em 50 mL) = 0,0075 g L-1

Média das Absorbâncias da diluição acima = 0,729

Concentração da diluição 3 mL de azul de toluidina + 1 mL de água = 0,0056 g L-1

Para calcular a concentração em mM L-1

Equação_2

Agora ficou fácil calcular o Coeficiente de Extinção Molar, pois basta lembrarmos da equação inicial A = e C L e que L é igual a 1, podemos reescrever essa equação isolando o coeficiente de extinção molar, que queremos calcular: 

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Como agora temos a absorbância de cada uma das diluições propostas e suas respectivas absorbâncias médias, podemos, enfim, calcular o coeficiente de extinção molar de cada uma das substâncias que deve retornar valores muito semelhantes, independente da concentração utilizada, veja o exemplo abaixo.

Equação_3

Pronto, já temos concluído os três passos para uma pesquisa básica da natureza química da substância em questão. Sugerimos agora que você tente calcular os Coeficientes de Extinção Molar de todos os reagentes utilizados nesta prática.


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