Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 13 – ESPECTRO DE AÇÃO DOS PIGMENTOS CLOROPLASTÍDICOS

Introdução

As moléculas de clorofila absorvem mais fortemente a radiação no comprimento de onda próximo do azul-violeta e do laranja-vermelho, podendo transmitir ou refletir quase toda a radiação na faixa do verde e do amarelo. Os fótons da radiação absorvida contém uma quantidade de energia que irá excitar um elétron localizado em cada um dos átomos da molécula de clorofila ou carotenoide. Esse processo ocorre nos tilacóides dos cloroplastos, mas especificamente no centro de reação dos fotossistemas. Quando a luz, em forma de energia, incide sobre uma molécula, parte dessa energia é absorvida seletivamente pela molécula, conforme sua estrutura molecular e atômica, uma vez que todas as moléculas apresentam um nível de energia, que além de ser característico segue a especificidade das moléculas que a compõem. Quando se estuda o efeito da luz de diferentes comprimentos de onda (usando quantidades não saturantes) num processo como a fotossíntese, obtém-se um espectro de ação. Entretanto, quando o espectro de ação é comparado com o espectro de absorção do pigmento há uma melhor interpretação da participação de diferentes pigmentos ao processo.


Objetivos específicos desta prática

Determinar os diferentes espectros de absorção de diferentes extratos cloroplastídios, advindos de diferentes materiais biológicos.


Procedimentos

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Figura 1. Pesagem do material vegetal

Pesa-se 500 mg do material vegetal (folha de couve, raiz de cenoura, pétalas vermelhas e pétalas brancas) (figura 1).


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Figura 2. Carbonato e areia sendo colocado no almofariz junto ao material vegetal

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Figura 3. Adição de 1mL de acetona a 80%

Após a pesagem, o material deve ser acomodado num almofariz de porcelana. Com as luzes da sala apagadas, mas com um pequeno feixe de luz de fundo, insere-se em cada almofariz uma pitada rasa de carbonato de cálcio, uma pitada maior de areia lavada de rio para facilitar a extração dos pigmentos (Figura 2) e cerca de 1 mL de acetona 80% (Figura 3).


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Figura 4.Maceração do material vegetal

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FIGURA 5. FILTRAGEM DO MATERIAL MACERADO

Em seguida, deve-se macerar muito bem o material até que não seja visível nenhum resíduo de material vegetal (figura 4).

Na sequência, deve-se transferir o macerado para um funil contendo papel de filtro qualitativo, procedendo-se a filtração. (Figura 5).


Fig_6

Figura 6. Completando o volume do extrato cloroplastídico filtrado para 10 mL com acetona a 80%

Recolha o filtrado em um balão volumétrico com volume de 10 mL e em seguida complete o volume do balão com mais acetona 80% (Figura 6). Fazendo isso para os diferentes materiais vegetais de forma separada, ao final teremos quatro estratos cetônicos de diferentes naturezas.


Fig_7

Figura 7. Extratos cetônicos recolhidos em cubetas de vidro

Agora que temos todos os extratos cetônicos, devemos recolher uma amostra desse material numa cubeta de vidro e ler em espectrofotômetro contra uma referência contendo apenas acetona 80% (Figura 7).

 

 

 

 

 


Observação: Se o valor de absorbância ultrapassar 0,900 significa que o extrato está muito concentrado e deve ser diluído com acetona a 80% para que o mesmo se adeque dentro dos princípios da Lei de Beer Lambert.

O extrato deve ser lido em diversos comprimentos de onda de modo a se fazer uma varredura em todo o espectro de luz visível (340 a 750 nm) (Figura 8).

Fig_8

Figura 8. Colocação da cubeta com uma possível leitura em espectofometro ao lado

Com os valores obtidos nas leituras, construa um gráfico, apresentando no eixo das abscissas os comprimentos de onda e no eixo das ordenadas as respectivas absorbâncias e em seguida identifique o comprimento de onda no qual cada um dos extratos melhor absorve a luz (Figura 9).


Resultados esperados

Fig_9

Figura 9. Espectros de ação dos mais diferentes materiais cetônicos. Perceber que cada material biológico utilizado apresenta diversos picos de absorção de luz, alguns particulares, outros que se repetem em todos os materiais utilizados. A linha vermelha, branca e verde, representam, respectivamente, extrato vegetal extraído de pétalas vermelhas e pétalas brancas ou de folhas de espinafre. A linha laranja representa extrato vegetal de raiz de cenoura.

Como pode ser verificado na Figura 9, cada extrato vegetal apresenta seu espectro de absorção específico, onde podem ser identificados diversos pigmentos, entre eles as clorofilas, tanto a quanto b ou os carotenoides. Pode-se perceber, ainda que o extrato vegetal de folhas de espinafre apresentam claramente dois picos de absorção bem característico, o que demonstra apresentar clorofilas, enquanto que os extratos de pétalas não apresentam o segundo pico, característico das clorofilas. Percebe-se ainda, a presença de um pico bem marcante na faixa de 420-450 nm no extrato de raízes de cenoura, que caracteriza que este extrato apresenta carotenoides.

TEOR DE CLOROFILA E CAROTENÓIDES EM FOLHAS


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