Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 15 – PARTIÇÃO DE PIGMENTOS FOTOSSINTÉTICOS

Introdução

Os pigmentos fotossintéticos são essenciais para o desenvolvimento dos vegetais, pois são responsáveis pela captura da energia solar incidente usada na fotossíntese. Além das clorofilas e dos carotenoides, as plantas sintetizam outros pigmentos, como os flavonóides, que constituem uma série de compostos relacionados, solúveis em água, tendo como estrutura básica um esqueleto C15 de flavona. Os flavonóides ocorrem universalmente nas plantas superiores, mas são incomuns entre as criptógamas. Encontram-se dissolvidos em água, no suco celular (no interior do vacúolo) tanto de folhas como em frutos e raízes, mas se acumulam especialmente nas flores, conferindo-lhes as cores características (mais detalhes em Pompelli et al., 2007). As clorofilas são compostos orgânicos formados por carbono, oxigênio, hidrogênio e, em seu centro de ligação um átomo de magnésio. A interação entre as moléculas de clorofilas são fracas, ou seja, não covalentes; assim essa interação é facilmente quebrada com solventes orgânicos com ou sem maceração dos tecidos. Entretanto, a natureza hidrofílica ou hidrofóbica do solvente é importante na escolha do método de extração das clorofilas. Sabendo disso, essa prática tem como objetivo mostrar ao aluno como se dá a partição de clorofilas e como elas se comportam frente a diferentes solventes orgânicos e pHs.


Objetivos específicos desta prática

Observar a separação de pigmentos hidrossolúveis e lipossolúveis, por meio de sua partição em solventes não miscíveis.

Acompanhar as variações das propriedades de alguns destes pigmentos, em função das variações do pH do meio ou de sua hidrólise parcial.


Procedimentos e Resultados esperados

Por mais que essa prática será desenvolvida com diferentes materiais vegetais, no presente procedimento, apresentaremos as fotos de apenas um material vegetal para facilitar a compreensão. Antes de iniciar a prática, deve-se separar os seguintes materiais vegetais: folhas de espinafre, pétalas de flores de cor amarela e vermelha e raiz de cenoura para a visualização dos pigmentos.

fig_1

Figura 1. Pesagem do material vegetal

De todos os materiais, devemos pesar em torno de 500 mg (Figura 1).


Em seguida, os materiais vegetais devem ser homogeneizados em um almofariz e pistilo de porcelana, adicionando-se 2 mL de acetona 80%. A maceração estará completada quando não se verificar mais fragmentos vegetais no pistilo (Fig. 2C).

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Figura 2. Procedimento sequencial de maceração do material vegetal com 2 mL de acetona a 80%

 


FIGURA 3AB.png

Figura 3. Etapas de filtragem: em dupla camada de gase (A) e em papel filtro qualitativo (B)

Após o material ser homogeneizado, segue-se com a filtragem. Primeiramente o material deve ser filtrado em dupla camada de gaze (Fig. 3A), para retirar as partículas sólidas e, em seguida, o material deve ser filtrado em papel de filtro qualitativo para completar o processo de filtração (Fig. 3B).


Após a filtragem, deve-se completar o volume para 10 mL em um balão volumétrico. Do filtrado, retira-se, então, 5 mL, os quais devem ser aplicados em um funil separador, adicionando, em seguida, igual quantidade de éter etílico PA e água destilada (nesta mesma ordem) (Figura 4).

FIGURA 4ABC.png

Figura 4. Montagem do funil separador com adição do extrato vegetal (A), do éter etílico (B) e da água (C)


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Figura 5. Formação de duas fases, contendo a parte hidrofílica, mais densa, na parte inferior do balão e a parte hidrofóbica, menos densa, na porção superior

Observação: Os solventes devem ser introduzidos no sistema lentamente, sempre escorrendo pelas paredes do funil. Posteriormente, execute movimentos rotativos leves no funil separador para que os solventes sejam misturados.

Depois de misturados todos os solventes, aguarda-se 5 minutos para que ocorra a separação de fases no funil separador. Desenhe ou fotografe o fato ocorrido (Figura 5).


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Figura 6. Partição das fases inferior (A) e superior (B)

Uma vez que esteja clara a separação das fases, recolha num tubo de ensaio, cerca de 5 mL da fase inferior (Fig. 6A) e a mesma quantidade da fase superior (Fig. 6B), identificando os dois tubos.

Observação: Como os tubos de ensaio não são graduados, recomenda-se inserir 5 mL de acetona nos tubos e marcar a altura do solvente. Esse procedimento é feito simplesmente para marcar o volume a ser recolhido.


Agora que já temos as duas fases recolhidas em tubos de ensaio próprio. Vamos partir para testes de pH e solubilidade dos extratos. Primeiramente vamos adicionar 5 mL de água destilada em cada um dos tubos de ensaio, independente da fase recolhida (Fig. 7).

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Figura 7. Adição de 5 mL de H2O nas fases superiores (A, B) e inferiores (C, D)


 Acrescente, agora, tanto na fase superior como na inferior, 2 mL de NaOH 0,1 M, observe o ocorrido e anote os resultados (Figura 8).

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Figura 8. Adição de 2 mL de NaOH 0,1 M, tanto na fase inferior (A) como na superior (B)


Em seguida, adicione novamente ao tubo da fase superior e inferior, 2 mL de HCl 0,1 M, observe o ocorrido e anote os resultados (Figura 9).

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Figura 9. Adição de 2 mL de HCl na fase superior (B) e inferior (C).


Por último, vamos inserir no tubo identificado como fase superior, 2 mL de KOH 0,1 M e observaremos os resultados.

Fig_10.jpg

Figura 10. Adição de 2 mL de KOH 0,1 M na fase superior (B, C) e inferior (D, E)

Ao final recolha os dados dos demais grupos e discuta os resultados amplamente.


Bibliografa complementar

Pompelli, M. F., DeBrito, G. G., Otoni, W. C., Guerra, M. P., 2007. Biotechnologies for ornamental plants: some insights to the Brazilian productive chain. Int J Hortic Sci 13, 51-59.


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