Introdução
Nos vegetais, os principais produtos da fotossíntese, acumulados como reserva de energia, são a sacarose e o amido. O amido é uma molécula orgânica que pode ser encontrado em diversas partes da planta como folhas, raízes, caules, sementes e frutos, e é formada pela combinação de dois polissacarídeos: amilose e amilopectina.
Há essencialmente dois tipos de amido: o amido primário ou transiente e o amido secundário ou de reserva. O primeiro é o amido que é formado durante o dia, como fonte energética para a respiração celular, essencialmente no período noturno, quando a folha não faz fotossíntese; esse tipo de amido é estocado no estroma dos cloroplastos e é rapidamente consumido. O segundo tipo de amido é o amido de reserva, que é estocado nos amiloplastos como fonte de energia mais duradoura. Se encontram basicamente em tecidos de reserva como caules tuberosos e raízes.
Nessa prática, procuraremos evidenciar o amido primário estocado nas folhas e mostrar seu consumo durante um período sem luz. Nossa meta ainda é mostrar que as partes mais verdes, e mais ricas em clorofila, acumulam mais amido que as partes amareladas da folha. Para tanto, as folhas serão coloridas com lugol para demonstração de amido. Uma prática simples e de fácil execução, facilmente executada bem sem equipamentos muito sofisticados.
Objetivos específicos desta prática
Relacionar a presença mais marcante de amido nas áreas mais esverdeadas de uma folha variegada
Demonstrar que o amido é consumido durante o período noturno.
Procedimentos
Preparação do álcool 80%, partindo de álcool 96% (v/v)
Com uma proveta de 250 mL, medir 240 mL de álcool etílico 96° e verter numa garrafa de vidro, tipo âmbar. Em seguida, medir mais 60 mL de água deionizada em outra proveta e verter o conteúdo diretamente no frasco âmbar. Homogenize a solução e identifique como Álcool 80%. Para outras concentrações de álcool utilize a fórmula abaixo:
onde Cf é a concentração final desejada (80%), Vf é o volume final desejado (300 mL),
Ci é a concentração do álcool etílico e Vi é o volume do álcool a ser utilizado.
Preparação da solução de lugol
Pese 0,5 gramas de iodeto de potássio (KI) e 0,1 grama de iodo ressublimado (I2).Em seguida dissolva o KI em um béquer utilizando a solução de álcool 80% recém preparada. Após a completa dissolução do KI, acrescentar o I2 e agitar bem a solução para que ocorra a dissolução mais rapidamente. Feito isso transfira a solução para um frasco de vidro tipo âmbar e identifique essa solução como SOLUÇÃO DE LUGOL FORTE. Essa solução deve ser armazenada em geladeira e pode ser usada até 12 meses após sua preparação.
Na hora do uso, dilua a solução de lugol forte para a concentração de 2%. Para tanto, pipete 2 mL da solução de lugol forte, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete com álcool 80%. Essa solução tem vida útil de até 7 dias em geladeira, portanto, procure preparar somente o volume que for usar.
Preparação do material vegetal
Folhas variegadas e não variegadas (e.g., jiboia; Epipremnum aureum) devem ser colhidas frescas (Figura 1)
Figura 1: Folhas de Epipremnum aureum variegadas (A) e não variegadas (B)
Das duas folhas coletadas, envolva uma delas em papel alumínio e mantenha-as protegidas da luz por 24 horas (Figura 2).
Figura 2: Folhas de Epipremnum aureum variegadas não variegadas, sem proteção (A) e protegidas da luz (B)
Antes de envolver, observe atentamente as folhas, desenhando ou fotografando a superfície para posterior comparação entre as regiões verdes e claras. Esse passo é muito importante, porque após a descoloração das folhas estas áreas não mais serão visíveis.
Figura 3: Folhas de Epipremnum aureum demonstrando as áreas escuras e claras da folha
Passado as 24 horas no escuro, as folhas variegadas ou não serão tratadas com água em ebulição. Para tanto, siga as instruções sugeridas na Tabela 1.
Tabela 1. Modelo para organização dos grupos de avaliação
Passado o tempo de fervura, transfira as folhas para uma solução de NaOCl 2%. Nessa condição a folha deve permanecer até sua completa despigmentação, que pode ocorrer após alguns minutos ou horas (Figura 4).
Figura 4: Despigmentação das folhas em solução de NaOC
Figura 5: Folhas de Epipremnum aureum após a coloração com lugol
Após a despigmentação, as folhas devem ser transferidas para um béquer contendo água desionizada para que os tecidos sejam reidratados.
As folhas despigmentadas devem ser distendidas em um vidro de relógio, com a face adaxial voltada para cima.
Cubra as folhas com algumas gotas da solução de lugol 2% e deixe o corante agir por cerca de 3 minutos (Figura 5).
Lave o excesso de lugol, estique a folha e observe a presença de manchas marrom-acastanhadas nas folhas (Figura 6).
Figura 6: Folhas de Epipremnum aureum após o tratamento de despigmentação e no ponto inicia
Resultados esperados
De posse da imagem inicial e da imagem final compare as duas e relacione as regiões mais verdes com a maior concentração de amido.
Como um dos objetivos dessa prática é relacionar as partes com maior concentração de amido com a maior concentração de clorofila, colete porções da região mais verde e porções da região mais amarelada da folha e proceda com a dosagem de clorofilas em ambas as partes. Para detalhes de como proceder a dosagem de clorofilas consulte a Aula Prática 14.
Demonstre, na forma gráfica as diferenças de concentração de clorofila nas diferentes partes das folhas variegadas e não variegadas (Figura 7).
Figura 7: Apresentação dos principais resultados da prática de dosagem de clorofilas em regiões verdes e amareladas de folhas de Epipremnum aureum
Após avaliar os resultados dessa prática, pode-se afirmar que os grãos de amido estavam concentrados nas áreas verdes da folha. Visualmente, percebe-se uma coloração amarronzada nas áreas verdes, enquanto que as áreas amarelas não foram coradas. O teste bioquímico comprovou a existência de uma maior concentração de clorofilas na área esverdeada da folha, confirmando, assim, com a teoria apresentada no início dessa prática.
