Introdução
Até a década de 30, acreditava-se que o O2 liberado no processo fotossintético era proveniente da cisão da molécula de CO2. Diversos experimentos foram desenvolvidos para se concluir que a H2O e não o CO2 seria a molécula que, ao ser clivada, produziria o O2.
Sabe-se que a fotossíntese é basicamente uma transferência de elétrons da molécula da água para o NADP+ que reage com moléculas orgânicas, no ciclo de Cálvin de forma a reduzir o CO2 atmosférico a trioses fosfato. Assim, qualquer molécula que seja capaz de receber os elétrons advindos da água poderia ser um redutor de Hill. Em situações artificiais de laboratório esse redutor é o DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol) que é um composto químico que, quando oxidado apresenta coloração azulada, coloração que desaparece com sua redução, acarretando na diminuição da absorbância a 600 nm (Fig. 1).
Figura 1. Esquema mostrando o processo de fotoredução do DCPIP, avaliado em comprimento de onda de 600 nanômetros
Entretanto, o Diuron [3-(3,4-Diclorofenil)-1,1-dimetiluréia], um herbicida muito utilizado na agricultura, é capaz de bloquear a transferência de elétrons entre o pool de quinonas, localizado entre os fotossistemas II e I, bloqueando a cadeia transportadora de elétrons e a fotossíntese. Neste caso, em específico, o DCPIP permanecerá oxidado e a coloração não deve mudar, mostrando como um herbicida pode levar a morte do vegetal por inibir a fotossíntese (Figura 2).
Assim, essa prática deve mostrar ao aluno como se processa in vivo a fotossíntese a partir da utilização de uma solução concentrada de cloroplastos os quais serão expostos a diferentes condições químicas e físicas com efeitos significativos sobre a taxa de fotossíntese.
Figura 2. Esquema mostrando a estrutura química dos principais bloqueadores (A) da cadeia transportadora de elétrons (B) dentro da etapa fotoquímica da fotossíntese. Adaptado de Blankenship (2010)
Objetivos específicos
Demonstrar como o efeito da intensidade luminosa afeta a atividade das reações de Hill em cloroplastos isolados;
Demonstrar o efeito de herbicida sobre a atividade fotossintética in vitro.
Procedimentos e Resultados esperados
Preparação da suspensão de cloroplastos
Reserve cerca de 20 gramas de limbo foliar de espinafre. Lave as lâminas foliares em água corrente, e seque-as com o auxílio de papel toalha.
Na sequência, triture o material vegetal em liquidificador com velocidade mediana, utilizando 100 mL de solução de sacarose (0,5 M) para manutenção do equilíbrio osmótico e garantir que os cloroplastos não se rompam. Mantenha essa solução sempre resfriada, utilizando banho de gelo. Cumpre ressaltar que todo esse processo deva ser executado no escuro, ou com luz difusa.
Figura 3. Processo de maceração do tecido vegetal
Após a homogeneização, a solução de cloroplastos deve ser filtrada com duas camadas de gaze (Figura 4a), recuperando o filtrado em pequenos tubos de centrífuga (Figura 4b).
Figura 4: Filtração da solução de cloroplastos (A); preparação para a centrifugação (B)
Centrifugue o conteúdo dos tubos por 10 minutos a uma velocidade de 3000 rpm, descartando, na sequencia o sobrenadante. Após, ressuspenda o pellet em 100 mL tampão fosfato 0,10 M (pH 6,5) mantido em banho de gelo até o uso.
Figura 5: Processo de centrifugação (A); Descarte do sobrenadante (B); Processo de ressuspensão do pellet em tampão fosfato de potássio
Cinética da redução do DCPIP
Figura 7. Preparo da reação de cinética de redução do DCPIP
Diretamente numa cubeta de vidro (ou tubo de ensaio), deve-se adicionar, nesta sequência: 0,7 mL de DCPIP (0,2 mM), 0,7 mL do tampão fosfato de potássio (TFK) 0,10 M (pH 6,5), 1,4 mL de água deionizada e por último 0,7 mL da suspensão de cloroplastos recém preparada. Mescle bem a mistura e leia a absorbância de 600 nm. Os valores da absorbância devem ficar entre 0,75 e 0,90 (Figura 7).
Figura 8. Montagem do sistema de fotorredução do DCPIP na presença de fonte luminosa a 10 cm
Na sequência posicione a cubeta a 10 cm da fonte de luz e leia a absorbância por 14 minutos com intervalos de 2 minutos entre cada leitura (Figura 8).
Construa um gráfico apresentando os valores obtidos das absorbâncias em cada um dos tempos (Figura 9).
Figura 9. Esquema mostrando graficamente a redução do DCPIP ao longo do tempo de exposição à luz.
Para avaliarmos o efeito da intensidade luminosa sobre a fotorredução do DCPIP vamos repetir o experimento acima em outras duas distâncias da fonte luminosa: 20 cm e 50 cm. Reproduza exatamente como acima e mostre os dados de forma gráfica, um ao lado do outro para evidenciar as diferenças.
FIGURA 10. ESQUEMA MOSTRANDO GRAFICAMENTE A REDUÇÃO DO DCPIP AO LONGO DO TEMPO DE EXPOSIÇÃO À LUZ EM FUNÇÃO DA EXPOSIÇÃO A DIFERENTES INTENSIDADES DE LUZ, PROMOVIDAS POR UMA FONTE LUMINOSA LOCALIZADA A 10 CM (A), 20 CM (B) E 50 CM (C) DAS AMOSTRAS.
Agora que já avaliamos o efeito da intensidade luminosa sobre a intensidade de redução do DCPIP promovido pela luz vamos avaliar o efeito da ação do herbicida Diuron sobre a fotossíntese.
Para tanto, vamos preparar 3 diferentes tubos de ensaio ou cubetas:
Tubo 1: 0,7 mL de TFK + 0,7 mL de DCPIP + 1,4 mL de água
Tubo 2: 0,7 mL de TFK + 0,7 mL de DCPIP + 1,4 mL de Diuron 0,10 mM
Tubo 3: 0,7 mL de TFK + 0,7 mL de DCPIP + 1,4 mL de Diuron 0,01 mM
Em seguida, vamos adicionar 0,7 mL da suspensão de cloroplastos em todos os tubos. Mescle todos os reagentes e leia a absorbância em 600 nm. Repita esse último passo e leia a absorbância por 14 minutos com intervalos de 2 minutos entre cada leitura.
Determine agora o delta (Δ) de absorbância, subtraindo a absorbância inicial pela absorbância final e divida esse valor pelo tempo transcorrido na reação: essa é a cinética da reação de Hill (fotorredução do DCPIP por minuto).
Anote todos os dados, apresente os resultados em gráficos e tabelas e discuta os resultados com os demais grupos.
Figura 11. Esquema mostrando graficamente a redução do DCPIP ao longo do tempo de exposição à luz em função da ausência (A) e presença de Diuron (B) como inibidor da cadeia transportadora de elétrons dentro do pool de quinonas.
Leitura complementar
Blankenship RE (2010) Photosynthesis: The light reactions. In ‘Plant Physiology, 5th edition. (Eds L Taiz and E Zeiger) pp. 163-197. (Sinauer Associates, Inc.: Sunderland, USA).