Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 19 – DEMONSTRAÇÃO DA ATIVIDADE RESPIRATÓRIA E VITALIDADE DE SEMENTES

Introdução

Um dos principais fatores para análise da qualidade fisiológica de sementes está ligada a sua vitalidade e, consequentemente, seu poder de germinação. Alguns testes práticos, como o uso do tetrazólio, para avaliar a qualidade das sementes e sua viabilidade são corriqueiramente realizados em laboratórios, e buscam mostrar a potencialidade do embrião em se desenvolver e formar uma plântula completa. Os sais de tetrazólio são incolores e solúveis quando oxidados, e produzem sais de formazana insolúveis e coloridos quando reduzidos.

Com o uso do tetrazólio, é possível verificar a presença in situ da atividade de desidrogenases, uma vez que as formazanas precipitam onde esta enzima ocorre. O teste se baseia na atividade das enzimas desidrogenases, particularmente a Malato Desidrogenase, que reduz o sal de tetrazólio nos tecidos vivos das sementes, onde íons de H+ são transferidos para o referido sal (Figura 1).

Fig_1.jpg

Figura 1. Reação de redução do 2,4,5 cloreto de trifenil tetrazólio com a formação de formazana insolúvel. Nas sementes, a reação catalisada pela malato desidrogenase necessita de NAD+ com a produção de NADH, catálise que aqui é simulada com o uso de um indicador corante – o 2,4,5 cloreto de trifenil tetrazólio

Quando a semente é imersa na solução de tetrazólio ocorre a reação de redução nas células vivas, resultando na formação de um composto vermelho, não difusível, conhecido como trifenilformazana, indicando haver atividade respiratória nas mitocôndrias, concluindo-se assim, que o tecido está viável. Desta forma, a coloração resultante da reação é um indicador da viabilidade pela detecção da respiração celular. Tecidos mortos (não viáveis) não reagem com a solução, e não se colorem. Sendo assim, esse é um teste rápido e prático baseado na observação da coloração obtida nas diferentes partes da semente, possibilitando a determinação da presença e a natureza das alterações nos tecidos.


Objetivo específico desta prática

Demonstrar a atividade desidrogenase em sementes, o que evidencia sua atividade respiratória e viabilidade.


Procedimentos e Resultados esperados

Anteriormente a aula prática, as sementes embebidas de feijão devem permanecer em água destilada para embeber por no mínimo 2 horas. Na hora da aula, cada grupo deve reservar cinco sementes de feijão.

As sementes devem ser enxugadas levemente com papel absorvente e inseridas em tubos de vidro com tampa, previamente envoltos com papel alumínio e identificados adequadamente com seu respectivo tratamento (Figura 2).

Sabendo que a atividade respiratória é proporcional a atividade biológica do tecido e diretamente proporcional a temperatura empregada; nesta prática testaremos os seguintes tratamentos: (i) sementes embebidas e incubadas a 25ºC; (ii) sementes embebidas e incubadas a 50ºC; (iii) sementes não embebidas e incubadas a 25ºC; (iv) sementes não embebidas e incubadas a 50ºC; (v) sementes previamente fervidas e posteriormente incubadas a 50ºC.

Fig_2

Figura 2. Tubos de ensaio contendo sementes de feijão (A) e envoltos com papel alumínio (B), devidamente, identificados com os tratamentos.

Em cada tudo de ensaio, insira cerca de 3 mL de solução de tetrazólio 0,075% e leve os tubos, devidamente tampados, às devidas temperaturas e tempos indicados em cada tratamento. Os tubos que permanecerão a 25ºC devem ser deixados sob a bancada e os tubos que serão levados a 50ºC, devem ser dispostos em banho-maria com temperatura controlada.

Após o tempo determinado em cada tratamento, retire as sementes dos tubos e descarte a solução de tetrazólio. Enxugue levemente as sementes, corte-as longitudinalmente e disponha-as sob papel branco para facilitar a comparação entre os tratamentos (Figura 3). Desenhe ou fotografe cada um dos tratamentos para melhor comparação entre eles.

Fig_3

Figura 3. Sementes de feijão mostrando os resultados da prática. A) sementes não embebidas incubadas a 25°C por 60 minutos; B) sementes embebidas e incubadas a 25°C por 60 minutos; C) sementes não embebidas incubadas a 50°C por 60 minutos; D) sementes embebidas e encubadas a 50°C por 60 minutos; E) Sementes não embebidas e incubadas a 50°C por 30 minutos; F) Sementes embebidas e incubadas a 50°C por 30 minutos; G) Sementes fervidas e incubadas a 50°C por 30 minutos.

Atenção: os tubos contendo as sementes devem ser mantidas no escuro, pois a solução de tetrazólio é fotossensível, e a luz pode alterar a coloração e comprometer os resultados do teste.


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