Introdução
Um dos principais fatores para análise da qualidade fisiológica de sementes está ligada a sua vitalidade e, consequentemente, seu poder de germinação. Alguns testes práticos, como o uso do tetrazólio, para avaliar a qualidade das sementes e sua viabilidade são corriqueiramente realizados em laboratórios, e buscam mostrar a potencialidade do embrião em se desenvolver e formar uma plântula completa. Os sais de tetrazólio são incolores e solúveis quando oxidados, e produzem sais de formazana insolúveis e coloridos quando reduzidos.
Com o uso do tetrazólio, é possível verificar a presença in situ da atividade de desidrogenases, uma vez que as formazanas precipitam onde esta enzima ocorre. O teste se baseia na atividade das enzimas desidrogenases, particularmente a Malato Desidrogenase, que reduz o sal de tetrazólio nos tecidos vivos das sementes, onde íons de H+ são transferidos para o referido sal (Figura 1).
Figura 1. Reação de redução do 2,4,5 cloreto de trifenil tetrazólio com a formação de formazana insolúvel. Nas sementes, a reação catalisada pela malato desidrogenase necessita de NAD+ com a produção de NADH, catálise que aqui é simulada com o uso de um indicador corante – o 2,4,5 cloreto de trifenil tetrazólio
Quando a semente é imersa na solução de tetrazólio ocorre a reação de redução nas células vivas, resultando na formação de um composto vermelho, não difusível, conhecido como trifenilformazana, indicando haver atividade respiratória nas mitocôndrias, concluindo-se assim, que o tecido está viável. Desta forma, a coloração resultante da reação é um indicador da viabilidade pela detecção da respiração celular. Tecidos mortos (não viáveis) não reagem com a solução, e não se colorem. Sendo assim, esse é um teste rápido e prático baseado na observação da coloração obtida nas diferentes partes da semente, possibilitando a determinação da presença e a natureza das alterações nos tecidos.
Objetivo específico desta prática
Demonstrar a atividade desidrogenase em sementes, o que evidencia sua atividade respiratória e viabilidade.
Procedimentos e Resultados esperados
Anteriormente a aula prática, as sementes embebidas de feijão devem permanecer em água destilada para embeber por no mínimo 2 horas. Na hora da aula, cada grupo deve reservar cinco sementes de feijão.
As sementes devem ser enxugadas levemente com papel absorvente e inseridas em tubos de vidro com tampa, previamente envoltos com papel alumínio e identificados adequadamente com seu respectivo tratamento (Figura 2).
Sabendo que a atividade respiratória é proporcional a atividade biológica do tecido e diretamente proporcional a temperatura empregada; nesta prática testaremos os seguintes tratamentos: (i) sementes embebidas e incubadas a 25ºC; (ii) sementes embebidas e incubadas a 50ºC; (iii) sementes não embebidas e incubadas a 25ºC; (iv) sementes não embebidas e incubadas a 50ºC; (v) sementes previamente fervidas e posteriormente incubadas a 50ºC.
Figura 2. Tubos de ensaio contendo sementes de feijão (A) e envoltos com papel alumínio (B), devidamente, identificados com os tratamentos.
Em cada tudo de ensaio, insira cerca de 3 mL de solução de tetrazólio 0,075% e leve os tubos, devidamente tampados, às devidas temperaturas e tempos indicados em cada tratamento. Os tubos que permanecerão a 25ºC devem ser deixados sob a bancada e os tubos que serão levados a 50ºC, devem ser dispostos em banho-maria com temperatura controlada.
Após o tempo determinado em cada tratamento, retire as sementes dos tubos e descarte a solução de tetrazólio. Enxugue levemente as sementes, corte-as longitudinalmente e disponha-as sob papel branco para facilitar a comparação entre os tratamentos (Figura 3). Desenhe ou fotografe cada um dos tratamentos para melhor comparação entre eles.
Figura 3. Sementes de feijão mostrando os resultados da prática. A) sementes não embebidas incubadas a 25°C por 60 minutos; B) sementes embebidas e incubadas a 25°C por 60 minutos; C) sementes não embebidas incubadas a 50°C por 60 minutos; D) sementes embebidas e encubadas a 50°C por 60 minutos; E) Sementes não embebidas e incubadas a 50°C por 30 minutos; F) Sementes embebidas e incubadas a 50°C por 30 minutos; G) Sementes fervidas e incubadas a 50°C por 30 minutos.
Atenção: os tubos contendo as sementes devem ser mantidas no escuro, pois a solução de tetrazólio é fotossensível, e a luz pode alterar a coloração e comprometer os resultados do teste.
