Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 2 – DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL OSMÓTICO PELO MÉTODO DE SCHARDAKOW

Introdução

Na maioria dos processos fisiológicos, o conhecimento do grau de saturação hídrica das células é de suma importância. Diversas relações têm sido apresentadas entre o estado hídrico de uma célula ou tecido e a energia livre da água. Esta energia é afetada por diversos fatores físicos e químicos ou meramente mecânicos. A concentração de solutos no vacúolo determina o potencial osmótico (ψs),enquanto a pressão hidrostática, condicionada pela parede celular, determina o potencial de pressão (ψp). Todos esses elementos compõem o potencial hídrico total (ψw) da célula ou tecido, que, em última instância, significa dizer que sua capacidade de ganhar ou perder água está sob estas condições físico-químicas.

A mensuração da atividade metabólica de um tecido vegetal é afetada pelo status energético da água nos seus tecidos. Devido a isso, e levando-se em consideração que as moléculas de água se movem através de um gradiente de potencial osmótico, torna-se importante a determinação do status energético da água nos diferentes tecidos vegetais ou mesmo em determinados tecidos da planta.

Entretanto, a correta determinação do potencial osmótico de um tecido vegetal, encontra inúmeras dificuldades no dia-a-dia. Uma delas é a correta extração do suco celular que não deve ser contaminado com outros fluídos, mas a correta calibração de equipamentos de medição também costuma trazer problemas se não corretamente realizada. Por outro lado, há maneiras simples, rápidas e baratas de determinar o potencial osmótico de um tecido vegetal sem a necessidade de complexos equipamentos ou sistemas de medição. Um destes métodos é o método densimétrico de Schardakow, o qual preconiza que a transferência de água entre amostras de tecido vegetal e soluções com potenciais osmóticos definidos e conhecidos, altera sua densidade. Essa densidade diminuirá ou aumentará de acordo com a perda ou absorção de água pelo tecido, ou seja, com o aumento ou diminuição do potencial osmótico da solução teste.


Objetivo específico dessa prática

Determinar o potencial osmótico de tecidos foliares utilizando uma sequência conhecida de concentração molar e seu potencial osmótico equivalente.


Procedimentos

Preparar 1 L de solução de sacarose 1 mol L-1, dissolvendo 342 g de sacarose em 1 L de água destilada. Atenção: primeiramente dissolva a quantidade de sacarose num pequeno volume de água e somente depois de dissolvida complete o volume para 1 L utilizando-se de um balão volumétrico.

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Figura 1: Passos sequenciais para pesagem (A,B), dissolução (C) e ajuste de volume final (D,E) de uma solução de sacarose 1 mol L-1

Em seguida, vamos preparar uma bateria de nove concentrações crescentes de sacarose (100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 e 500 mmol L-1), partindo-se sempre da solução recém preparada. Vamos preparar 10 mL de cada solução. Para tanto, utilize-se da fórmula abaixo para preparar as demais concentrações:

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Ou seja, utilize 1 mL da solução de sacarose 1 mol L-1 e complete para 10 mL utilizando um balão volumétrico

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Figura 2: Passos sequenciais para preparo (A,B) e armazenagem (C,D) da bateria de soluções com concentrações crescentes

De posse da bateria de soluções, adicione cerca de 2 mL dessa solução em cada tudo de ensaio pequeno (Ø de 10 mm) e a mesma quantidade em outros tubos maiores (Ø de 15 mm). Identifique os tubos de ensaio pequeno como “tubos padrão” e os tubos grandes como “tubos teste”.

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Figura 3: Adição de 2 mL de cada uma das sete soluções em tubos pequenos (A) e grandes (B)

Do material indicado pelo monitor (recomenda-se folhas de Tradescantia sp. ou Coleos blumei), retire pequenos fragmentos retangulares de 5 x 7 mm e insira 5 destes fragmentos em cada um dos tubos teste. Os tubos padrão devem ser reservados por enquanto.

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Figura 4: Preparo do material vegetal e inserção nos tubos grandes

Aguarde cerca de 1 hora e insira em cada um dos tubos teste um pequeno cristal de azul de metileno ou violeta cristal. O objetivo desse cristal é colorir a solução que será agora usada como teste de osmolaridade.

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Figura 5: Preparo dos tubos teste com a adição de um cristal de azul de metileno

Com o auxílio de uma pipeta de Pasteur ou micropipeta de 200 µL, retire uma pequena fração de cada uma das soluções teste e insira esta gota em cada tubo equivalente a mesma concentração molar. Faço isso bem no centro do perfil da solução.

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Figura 6: Adição de uma pequena gota da solução teste sobre a solução padrão (tubos pequenos)


Resultados esperados

Ao término da adição, você deve perceber que algumas gotas, mesmo sendo adicionadas no meio da solução padrão, somem enquanto outras descem.

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A correta explicação destes resultados se dá por diferença de potencial osmótico. Inicialmente as duas soluções: teste e padrão estavam com a mesma concentração. Mas ao entrar em contato com os fragmentos foliares, as soluções teste entraram em equilíbrio osmótico com os fragmentos de tecido vegetal, de forma a: (1) ceder água para os tecidos vegetais, quando o potencial osmótico destes eram mais negativos do que o potencial osmótico da solução teste ou (2) receber água dos tecidos vegetais, caso a solução teste tenha um potencial osmótico mais negativo.

 A inferência do potencial osmótico dos tecidos vegetais se dá então, no exato momento onde a gota azul da solução teste estacionou (nem subiu, nem cedeu) quando inserida na solução padrão. No nosso caso, isso aconteceu na concentração de 350 mM. Para calcular, agora o potencial osmótico da solução devemos relembrar a equação de Vant’off, ver abaixo:

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Entretanto, pode acontecer que não se encontre esse perfeito equilíbrio. Neste caso recomenda-se fazer soluções padrão com concentrações mais estreitas entre os dois níveis de potencial osmótico duvidoso. Por exemplo: na solução de 300 mM a gota subiu, enquanto que na solução de 400 mM a gota desceu. Neste caso faça soluções padrão com concentrações entre 300 e 400 mM, com intervalo de 10 em 10 ou de 20 em 20 mM.


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