Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 32 – IDENTIFICAÇÃO DE n-ALCANOS DA CERA EPICUTICULAR FOLIAR

Introdução

A cutícula vegetal funciona como uma interface natural entre a planta e o ambiente externo. Estruturalmente a cutícula é formada por uma matriz biopolimérica de componentes lipídicos predominantemente alifáticos e de baixa polaridade. A cera epicuticular nas plantas superiores é formada por uma complexa mistura de compostos alifáticos de cadeia longa como n-alcanos, álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres e ácidos carboxílicos, além de compostos cíclicos como triterpenos e flavonoides. A cera apresenta como função básica para a planta a proteção contra perda excessiva de água, mas outras funções são a ela atribuídas como atenuação de radiação fotossintética ativa e UV e a proteção contra a ação de patógenos. Na cera, uma das classes de compostos de maior ocorrência são os n-alcanos, e devido ao seu caráter hidrofóbico pode proporcionar às plantas uma maior eficiência do uso da água em condições de déficit hídrico. Estes compostos serão melhor estudados na presente prática.


Objetivos específicos desta prática

Efetuar a extração de cera epicuticular e posteriormente a separação das classes de compostos da cera epicuticular por cromatografia em camada delgada;

Isolar os n-alcanos cuticulares por CCD e identificar o perfil de n-alcanos cuticulares usando cromatografia gasosa (CG).


Procedimentos

Primeiramente selecione folhas integras. Nesta prática utilizaremos folhas de Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae), mas pode ser utilizada folhas de outra espécie. Coloque a folha inteira em um recipiente contendo clorofórmio ou diclorometano e deixe-a imersa por até 60 segundos (Figura 1). Agite o recipiente suavemente durante este tempo. Em seguida, filtre o extrato em papel filtro com sulfato de sódio anidro e transfira o filtrado para um balão de fundo redondo. Concentre o extrato em rotaevaporador à 60°C e com auxílio de uma pipeta Pasteur de vidro transfira o extrato para um tubo de penicilina. Mais detalhes desses passos ver Prática 29.

fig_1

Figura 1. Método de extração de ceras cuticulares: A – vista aérea da folha no interior do Becker; B – vista lateral da folha coberta pelo solvente


Preparar uma solução de fluoresceína sódica 0,02%, diluindo 10 mL de fluoresceína a 0,2% em 90 mL de água destilada. Em seguida, pese 45 a 50 g de sílica gel G-60 e misture os 100 mL da solução de fluoresceína (Figura 2). Verta aproximadamente 30 mL dessa solução em uma placa de vidro 20 x 20 cm, espalhando a solução por toda placa com auxílio de bastão de vidro distribuindo igualmente a solução sobre a placa deixando secar por 24 h. Antes do uso, as placas devem ser colocadas em estufa a 100°C por 30 min.

Fig_2.jpg

Figura 2. Material utilizado na preparação da placa (da esquerda para a direita): fluoresceína sódica, 45 g de sílica em gel, fluoresceína a 0,02% em 90 mL de água destilada e frasco de vidro para mistura

Prepare a fase móvel (sistema eluente) da cromatografia em camada delgada (CCD) com uma mistura de n-hexano:clorofómio (ou diclorometano) misturando 73 mL de n-hexano e 27 mL de clorofórmio ou diclorometano (73:27 v/v). Verta o sistema eluente na cuba cromatográfica de vidro e tampe para concentrar o sistema. Aplica-se o extrato de cera com auxílio de um capilar de vidro na forma de uma faixa contínua ao longo da placa deixando uma margem de dois centímetros da base da placa e colocar na cuba cromatográfica contendo o sistema eluente concentrado.


Fig_3.jpg

Figura 3. Cromatograma em camada delgada (CCD) mostrando faixas que correspondente as diferentes classes de compostos da cera epicuticular foliar de Jatropha curcas. A faixa superior corresponde aos n-alcanos

As classes que compõem a cera devem ser visualizadas sob luz UV (pode ser usada uma luz negra de 25 watts). A classe correspondente aos n-alcanos será a faixa mais superior da placa (Figura 3) que deve ser removida na capela, com auxílio de uma espátula; em seguida, a faixa isolada deve ser transferida para papel de filtro e lavado com clorofórmio (ou diclorometano). Transfira a fração dos n-alcanos para tubo de penicilina e evapore o excesso de solvente em um banho-maria (use capela).

 


Os n-alcanos obtidos por CCD serão analisados por cromatografia gasosa (GC/FID) (Figura 4). Solubilize o extrato contendo os n-alcanos com aproximadamente 0,5 mL n-hexano e injete 1 µL no cromatógrafo com a seguinte programação: hélio como gás de arraste com fluxo constante de 1 cm3/min; coluna capilar de sílica fundida DB-5 (5%-fenil-metilpolisiloxano); temperatura inicial da coluna 150ºC/3 min, elevando-se 10ºC/min até 280ºC, permanecendo nesta temperatura por 34 min; temperatura do injetor 250ºC; temperatura do detector de ionização em chama (FID) 300ºC. Identifique os n-alcanos por comparação com tempos de retenção de padrão autêntico desses compostos (C21- C40 Fluka S.A, Costa Rica) e quantifique pelo método de normalização da área do pico para obter os dados em percentual (%).

Fig_4.jpg

Figura 4. Cromatógrafo gasoso com detector de ionização em chama (FID) utilizado nas análises do perfil de n-alcanos cuticulares


Resultados esperados

Nesta prática vamos identificar o perfil de n-alcanos cuticulares e identificá-los por comparação com os tempos de retenção de um padrão autêntico comercial de n-alcanos (C21- C40 Fluka S.A, Costa Rica). Utilize o cromatograma abaixo como exemplo.

fig_5

Figura 5. Perfil de n-alcanos cuticulares (C21- C37)


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