Introdução
O DNA (do inglês: “desoxyribonucleid acid”, ácido desoxirribonucleico) é o carregador da informação genética que define os indivíduos de qualquer organismo. Como o DNA está sempre em evolução, devido a mutações e rearranjos genômicos, não existem dois organismos com o mesmo genoma. As diferenças são relativamente pequenas entre indivíduos da mesma espécie e aumentam com a distância filogenética entre as espécies. Este fato pode ser aproveitado para um grande número de análises moleculares, como por exemplo, a determinação de paternidade, a detecção de presença de um virus no genoma do portador, análise de estrutura populacional, ou a reconstrução de uma árvore filogenética. O primeiro passo fundamental em qualquer um desses (e outras) análises de DNA genômico (nuclear ou organelar) é a sua separação dos demais constituintes do tecido vegetal. Esse processo se chama “extração” e busca obter o DNA no grau de pureza necessário para o tipo de análise em questão. Na biologia molecular em plantas, podem ser usadas vários tecidos vegetais, embora sendo folhas o material mais utilizado.
Objetivo específico desta prática
Extrair DNA genômico vegetal, utilizando um método simples, rápido e não tóxico.
Procedimentos e Resultados esperados
Separe cerca de 1 g de material vegetal para iniciar a extração do DNA genômico (Figura 1).
Figura 1. Pesagem de cerca de 1,0 g de folhas da cebolinha Nothoscordum pulchellum
Figura 2. Preparo do tampão de extração
Prepare o tampão de extração com 1,5 g de sal de cozinha, 5,0 g de bicarbonato de sódio e 120 mL de água destilada, adicionando 5 mL de detergente logo antes de uso. A solução é preparada num béquer de 250 mL (Figura 2).
Em seguida, corte as folhas em pequenos pedaços (Figura 3a) e insira-os em um almofariz de porcelana (Figura 3b)
Figura 3. Preparo do material vegetal para maceração
Adicione, então, 10 mL de tampão de extração e macere vigorosamente com o pistilo por pelo menos 5 min (Figura 4a). O resultado da maceração deve ser uma suspensão homogênea (Fig. 4b).
Figura 4. Processo de maceração em tampão de extração, com o auxílio do pistilo e almofariz (A) e material vegetal macerado, em suspensão homogênea (B).
Acondicione um filtro de papel (tipo filtro de café) enrolado e aberto em um tubo de polipropileno (tipo tubos de falcon) (Figura 5a) e verta a suspensão no filtro (Figura 5b). A filtração pode demorar alguns minutos. É possível acelerar o processo espremendo o papel filtro com um palito contra a parede do tubo. O volume do filtrado deve alcançar pelo menos 5 mL.
Figura 5. Filtração da suspensão
Figura 6. Adição de isopropanol gelado
Adicione lentamente dois volumes (duas vezes o volume que obteve do filtrado) de isopropanol gelado, mantendo o tubo falcon em um ângulo de 30º a 45° (Figura 6).
Faça movimentos circulares com o falcon cuidadosamente por alguns minutos e depois deixe a amostra em repouso até aparecer uma “nuvem” na fase intermediária entre o filtrado e o isopropanol. Essa nuvem contém o DNA (Figura 7).
Figura 7. Observação da nuvem de DNA se formando gradativamente na interface entre a fase aquosa (abaixo) e o álcool (acima)
Figura 8. O DNA pescado e transferido para um microtubo
Remova a nuvem de DNA com um bastão de madeira e a coloque num microtubo de 1,5 mL com 1 mL de etanol 70% (Figura 8).
Centrifugue a solução durante 5 min a uma velocidade de 14.000 rpm. Não deixe de equilibrar a centrífuga com outro microtubo contendo o mesmo volume de líquido (Figura 9). No fundo do tubo irá se formar um pellet de DNA precipitado.
Figura 9. Balanceamento de amostras na centrífuga
Descarte o sobrenadante e deixe o pellet secar invertendo o tubo. Quando não se percebe mais o cheiro do etanol, o pellet pode ser ressuspendido em 10-100 µL de água, dependendo do tamanho.
