Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 41 – AMPLIFICAÇÃO DE MICROSATÉLITE

Introdução

A técnica de PCR (do inglês: polymerase chain reaction – reação em cadeia da polimerase) foi descrita ainda na década de 1980, e revolucionou a biologia molecular, assim como a biologia dos organismos e das populações, pois permite a geração e a análise de bilhões de cópias de qualquer fragmento de DNA, mesmo com um mínimo de tecido disponível. Antes disso, a identificação, clonagem e a purificação de qualquer fragmento de DNA era difícil e trabalhosa, além de se restringir aos organismos com grandes quantidades de DNA disponíveis. A PCR baseia-se na ação da enzima Taq DNA polimerase, purificada da bactériaThermus aquaticus, que em cada ciclo catalisa a geração de novas cópias do fragmento de DNA em questão. A técnica da PCR vem sendo aplicada comumente em diversas abordagens, como no sequenciamento, na clonagem e na detecção de genes, além de ser amplamente utilizada nas áreas da medicina (em diagnósticos de viroses, infecções bacterianas e certos tipos de câncer), da análise forense (identificação de pessoas através de pelos ou sangue) e da biologia (filogenia molecular, genética de populações).


Objetivo específico desta prática

Amplificar um loco de microssatélite com a técnica de reação em cadeia da polimerase.


Procedimentos e Resultados esperados

Com base no volume final da reação (25 µL; Tabela 1), calcule o volume inicial (ou seja, o volume a ser pipetado) de cada reagente, partindo das concentrações iniciais e finais, usando a seguinte fórmula:

equacao-1-1

onde, C = concentração, V = volume,  i = inicial e f = final

Vamos calcular, então quantos microlitros precisamos pipetar para preparar uma solução 1,5 mM, partindo-se de um estoque de 50 mM.

equacao-2-1

Observação: A quantidade de DNA desejada por reação está expressa em massa, não concentração, e o cálculo do volume necessário deve ser feito por regra de três. A concentração da Taq é indicada em unidades por microlitro (U/µL). Assim como para o DNA alvo, é preciso calcular por regra de três o volume em relação à quantidade em U desejada.

Tabela 1. Concentração inicial e final de todos os reagentes necessários para o PCR

tabela-1


fig_1-4

Figura 1. Inicie a pipetagem pela substância de maior volume (água)

 

Pipete o volume calculado de cada reagente em um microtubo identificado (turma/grupo), sempre utilizando o micropipetador com volume adequado. Começa-se com o volume maior (neste caso, a água; Figura 1) e em seguida os volumes menores, sempre anotando o que já foi pipetado. Os tubos devem ser mantidos sob refrigeração (em gelo, fechados) enquanto os pipetadores são ajustados e os reagentes pipetados. Abra os tubos apenas para colocar os reagentes.

 

 

 

 


Segure o microtubo e o pipetador em posição vertical durante a pipetagem (Figura 2a). A forma correta de pipetar é apertando o êmbolo com o polegar e segurando o pipetador com os demais dedos (Fig. 2b).

fig_2-4

Figura 2. Pipetagem de cada reagente de acordo com o volume calculado (sempre do maior para o menor volume) (A) e Posição correta para manusear o pipetador (B)

 


fig_3-3

Figura 3. A última substância a ser pipetada deverá ser a Taq DNA polimerase

Adicione a Taq polimerase por último, pois é preciso mantê-la resfriada o máximo de tempo possível para preservar sua atividade (Figura 3).

 

 

 

 

 

 

 


Misture bem a solução no microtubo, utilizando, se disponível, um agitador do tipo vórtex e spin, e coloque os microtubos com as amostras no termociclador (Figura 4a). O termociclador será programado da seguinte maneira: 1º ciclo – 92°C por 10 min; 2º ciclo – 30× (92°C por 1 min, 60°C por 1 min, 72°C por 1 min); 3º ciclo – 72°C por 5 min, seguido por 10°C até a retirada da amostra (Figura 4b). Esse programa deve ser ajustado a depender do loco SSR a ser analisado.

fig_4-4

Figura 4. Disposição das amostras no termociclador (A) e ajuste da programação do termociclador de acordo com o ciclo sugerido para a região a ser analisada (B)


 Após a PCR, as amostras podem ser mantidas na geladeira a uma temperatura de 10ºC por curtos períodos de tempo ou no congelador a -20ºC até análise dos resultados.


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