Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

Início » AULA 42 – ELETROFORESE

AULA 42 – ELETROFORESE

Introdução

A eletroforese é uma técnica que baseia-se na migração diferencial de moléculas quando submetidas a um campo elétrico (um pólo positivo e um pólo negativo). A técnica parte do princípio que três fatores principais estarão influenciando a corrida de tais moléculas: a carga, o tamanho e o formato da molécula, sendo os dois primeiros os mais decisivos. Devido aos seus grupos fosfato, o DNA é uma molécula de carga negativa que, quando submetido a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo. Assim sendo, duas moléculas de DNA distintas de tamanhos diferentes migrarão no campo elétrico na mesma direção (pólo positivo), mas em velocidades diferentes, sendo que a menor migrará mais rápido que a maior. Por tais propriedades, a técnica de eletroforese vem sendo amplamente empregada em diferentes atividades da biologia molecular (análise da quantidade e qualidade do DNA extraído, confirmação da amplificação por PCR e análise da informação gerada, isolamento de fragmentos de DNA de tamanhos distintos, dentre outros).


Objetivos específicos desta prática

Separar fragmentos de DNA vegetal de diferentes tamanhos através de eletroforese em gel de agarose, para analisar o DNA genômico extraído (Aula Prática 40) e os produtos da PCR de um loco de microssatélite (Aula Prática 41).


Procedimentos e Resultados esperados

Para a análise do DNA genômico será utilizado um gel de agarose 1%. O cálculo de quanto será utilizado de agarose deverá ser de acordo com o tamanho da cuba e com a porcentagem desejada. Por exemplo, para uma cuba de 35 mL e um gel de 1%, serão utilizados 0,35 g de agarose e 35 mL de tampão (normalmente o TAE). O preparo do gel realizado da seguinte maneira: (i) acrescente a agarose em pó ao tampão 1× TAE e esquente cuidadosamente em um forno de microondas até o líquido ficar completamente transparente; (ii) depois de esfriar até cerca de 60ºC, verta o líquido em uma cuba com delimitadores e um ou vários pentes (Figura 1) e (iii) deixe o gel solidificar durante cerca de 30 min. Após solidificado, coloque o gel na cuba e adicione tampão 1 × TAE até submergir completamente o gel.

fig_1-5

Figura 1. Cuba em gel de agarose (3%) para eletroforese de loco de microssatélite (com moldes e dois pentes)


fig_2-5

figura 2. Em cada amostra se pipetará 5 µL de DNA, 2 µL de água, 2 µL de corante e 1 µL  de tampão 10 × TC

 

Prepare as amostras, adicionando, além do DNA, um tampão de carregamento ou amostra que dará peso à amostra e auxiliará na visualização durante a pipetagem e a corrida eletroforética (10 × TC), um corante que se liga de forma estável ao DNA e que é detectável sob luz UV e água para ajustar as concentrações. Separe um microtubo (0,5 ou 1,5 mL) para cada amostra, identificando-o, e em cada tubo prepare uma solução contendo o DNA, o tampão de carregamento (10 × TC), o corante e a água destilada, sempre do maior para o menor volume. Primeiramente, 5 µL de DNA são pipetados no microtubo, seguido por 2 µL de água, 2 µL de corante e 1 µL de TC (Figura 2).

 


fig_3-4

Figura 3. Pipetagem da amostra no poço do gel

Homogenize e pipete as amostras cuidadosamente nos poços do gel de agarose 1%, sendo uma amostra por poço (Figura 3). A mesma ponteira pode ser usada para aplicar as várias amostras no gel, lavando-a com o TAE na cuba depois de pipetar cada amostra. Além das amostras, deve ser pipetada uma escada de 1 Kb por pente, preparada de acordo com as instruções do fabricante.

 

 

 

 


Feche a cuba com a tampa e conecte-a a uma fonte na qual é aplicada uma corrente de 80 V por 15 min (Figura 4). A amostra vai correr em direção do polo positivo (anodo, vermelho).

fig_4-5

Figura 4. A cuba ligada à fonte de eletroforese, fazendo com que a amostra corra em direção ao polo positivo (anodo vermelho) (A) e ajuste da fonte para 80 V e 15 min, sendo a amperagem máxima permitida de 120 mA (B)


Após a corrida, o gel é posto sobre o transiluminador acoplado a um sistema de captura de imagens. O gel é visualizado e a imagem é armazenada (Figura 5).

Cuidado para não se expor à luz ultravioleta!

fig_5-2

Figura 5. Eletroforese em gel de agarose de DNA genômico (a) e produto de PCR de SSR (b). (a) Gel de agarose 1% de agarose mostrando DNA de Nothoscordum pulchellum (Alliaceae), extraído com protocolo MacGyver. Observa-se em cada amostra (1-5) uma banda acima da maior banda da escada (10 kb) e rastro abaixo desta banda em maior ou menor intensidade, indicando que o DNA genômico extraído estava parcialmente degradado, em maior ou menor proporção. (b) Gel de 3% de agarose mostrando produtos de PCR do loco C12_1 de Podocarpus sellowii (Podocarpaceae). Observa-se que todas as amostras possuem uma banda de em torno de 250 pb. As amostras 3 e 6 são heterozigotas, com uma banda adicional na altura de 210 pb. Na amostra 6 também houve amplificação de um produto não específico mais evidente na altura de ca. 380 pb.


Para a análise dos locos microssatélites amplificados na prática de PCR, os mesmos procedimentos devem ser adotados, mas a concentração do gel deve ser alterada para 3% (por exemplo, para 35 mL de gel, utilize 1,05 g de agarose).

O gel de agarose permite verificar o sucesso da extração de DNA, permitindo avaliar tanto quantitativa quanto qualitativamente as amostras. Neste caso, é observada uma banda de alto peso molecular (Fig. 1a). Um rastro abaixo da banda é indicativo de uma baixa qualidade do DNA extraído com muitos fragmentos pequenos (DNA fragmentado). Quanto mais fortemente corada a banda, maior a quantidade de DNA extraído (aproximadamente equivalente à banda da escada com intensidade similar).

Para o loco de microssatélite utilizado, C12_1 de Podocarpus sellowii, esperam-se bandas em torno de 200-250 pb (Fig. 1b). As amostras devem ter uma ou duas bandas de diferentes tamanhos, indicando a presença de diferentes alelos em indivíduos com diferentes genótipos. Duas bandas indicam que estes indivíduos são heterozigotos no loco amplificado, enquanto uma banda indica que o indivíduo é homozigoto para o loco em questão. Se não aparecer nenhuma banda, significa que não houve amplificação durante a PCR, sendo o motivo mais provável um erro na pipetagem da PCR (por exemplo, falta de um reagente). O aparecimento de bandas adicionais indica que o anelamento do primer não foi restrito ao loco alvo, resultando em amplificações inespecíficas. No dia-a-dia, é comum que alguns locos não amplifiquem, apesar da pipetagem correta dos reagentes, se os primers usados não forem compatíveis com o DNA alvo, ou devido à baixa qualidade do DNA alvo, que pode conter impurezas que inibem a atividade da enzima durante a reação de PCR.

Observa-se em cada amostra (1-5) uma banda acima da maior banda da escada (10 kb) e rastro abaixo desta banda em maior ou menor intensidade, indicando que o DNA genômico extraído estava parcialmente degradado, em maior ou menor proporção. (b) Gel de 3% de agarose mostrando produtos de PCR do loco C12_1 de Podocarpus sellowii (Podocarpaceae). Observa-se que todas as amostras possuem uma banda de em torno de 250 pb. As amostras 3 e 6 são heterozigotas, com uma banda adicional na altura de 210 pb. Na amostra 6 também houve amplificação de um produto não específico mais evidente na altura de ca. 380 bp.


Avançar para a próxima aula prática                                              Retornar a prática anterior                              Retornar ao início do capítulo
%d blogueiros gostam disto: