Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 44 – DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BRADFORD

Introdução

A dosagem de proteínas permite a quantificação exata da concentração de proteínas numa determinada amostra vegetal; sendo uma etapa fundamental devido à necessidade de se utilizar uma concentração conhecida nas etapas subsequentes. O ensaio de Bradford, que tem por base o azul brilhante de Coomassie, é o método mais usado para dosagem de proteínas totais, com faixa de detecção entre 20 e 2000 μg mL-1, e utiliza a albumina do soro bovino (BSA) como padrão, que é um reagente de baixo custo. O reagente azul brilhante de Coomassie altera a absorbância de 465 nm para 595 nm causando uma visível mudança de coloração, inicialmente castanha, para tons de azul, conforme a concentração de proteínas. A leitura da absorbância possui sensibilidade a partir de 1 μg de proteína e é realizada em espectrofotômetro ou leitor de microplacas, cuja intensidade da coloração é proporcional ao teor protéico da amostra. O procedimento consiste em realizar a leitura de diferentes concentrações conhecidas de BSA para elaboração de curva padrão a partir da equação da reta e cálculo da quantidade de proteína presente. A comparação dos resultados com valores de concentrações conhecidos da curva padrão permite a determinação da concentração da proteína nas amostras em estudo.


Objetivos específicos desta prática

Construção da curva padrão;

Realizar a dosagem de proteínas totais de diferentes amostras vegetais (folhas e raízes);

Avaliação do perfil protéico em gel de poliacrilamida 12,5% de diferentes concentrações dos extratos protéicos dosados pelo método de Bradford (5, 50 e 100 µg).


Procedimentos

Preparo da curva padrão

Distribua seis tubos de ensaio em uma estante, numerando-os de 1 a 6.

fig_1-1

Figura 1. Estante com tubos de ensaios numerados de 1 a 6

Utilizando as micropipetas de acordo com o volume pretendido, adicione água destilada, BSA (dissolvido em água para concentração final de 1 µg µL-1) e o reagente de Bradford nas proporções sugeridas na Tabela 1.

 

Tabela 1. Proporção de componentes a serem distribuídos em tubos de ensaio para determinação da curva padrão.Tabela 1.jpg

Após mesclar todos os itens constantes na tabela 1, agite os tubos em agitador de tubos do tipo vortex, deixando, em seguida, os tubos de repouso por cerca de 5 minutos. A calibração do espectrofotômetro para o valor da absorbância zero deve ser realizada utilizando-se água destilada na cubeta e 595 nm. Em seguida, coloque o conteúdo do tubo nº 1 na cubeta, e registre a leitura da absorbância. Da mesma forma, deve ser feita a leitura da absorbância dos tubos 2 a 6. Com os valores das absorbâncias dos tubos preencher a Tabela 2 e determinar a curva padrão como base em BSA (Figura 2).

Fig_2 (1).jpg

Figura 2. Esquema geral das etapas de preparo e leitura da absorbância das amostras. A- Vortex por 30 segundos; B-Aspecto geral dos tubos contendo água, BSA e o reagente de Bradford após 5 minutos de incubação e C- Amostra disposta em cubeta para leitura em espectrofotômetro

Tabela 2. Completar a tabela com os valores obtidos após leitura dos tubos de ensaio 1 a 6 em espectrofotômetroTabela 2.jpg

A curva padrão da absorbância obtida em relação à concentração de BSA pode ser construída com o auxílio do programa Microsoft® Excel, no qual será obtida a equação da reta que servirá para definir a concentração de proteínas totais.


Dosagem de proteínas vegetais

O experimento consiste em quantificar a concentração de proteínas vegetais de folhas e raízes, previamente extraídas. Inicialmente, devem ser separados 5 tubos de ensaio para cada amostra, os quais devem ser montados conforme sugere a tabela 3.

Tabela 3. Proporção de componentes a serem distribuídos em tubos de ensaio para quantificação de proteínas de acordo com o Método de BradfordTabela 3.jpg

Em seguida, realize a leitura da absorbância a 595 nm em espectrofotômetro, e anote os valores obtidos anotados na tabela 4.

Tabela 4. Anotação dos valores obtidos em espectrofotômetroTabela 4.jpg

Submeter os valores de absorbância à curva de calibração previamente construída e obter o gráfico referente a cada uma das amostras. Discutir em grupo os resultados obtidos.


Resultados esperados

Ao final desta aula será obtida uma tabela de valores referentes à dosagem de proteínas totais de diferentes amostras vegetais. Será possível observar que, em geral, tecidos (folhas e raízes) de plantas jovens apresentam menos interferentes na leitura de absorbância em comparação com tecidos de plantas maduras. Quando observadas no gel as amostras de tecidos jovens tendem a se mostrar mais limpas e com padrão de bandas definido, enquanto que amostras de tecidos maduros apresentam um padrão “manchado” e, em alguns casos, bandas pouco visíveis.

Outro aspecto importante refere-se à visualização de diferentes concentrações (5, 50 e 100 µg) das amostras em gel de poliacrilamida e a avaliação da influência de interferentes em cada uma das amostras. Quanto mais concentradas as amostras mais interferentes, como compostos fenólicos, pigmentos ou proteínas degradadas pelo processo de extração, irão influenciar na eficiência de separação das amostras no gel. A aplicação de uma baixa concentração (5 µg) ou média concentração (50 µg) resultarão em um padrão de bandas melhor definidas enquanto que uma alta concentração do extrato proteico (100 µg) interfere negativamente no padrão eletroforético.

Desta forma estudos envolvendo proteínas vegetais devem considerar a idade do tecido a ser analisado e realisar cuidadosamente a dosagem dos extratos proteicos afim de obter géis com um padrão de bandas facilmente analisáveis.

A figura 3 apresenta um esquema didático de fácil visualização do processo com um todo.

Fig_3 (1).jpg

Figura 3. Esquema geral do preparo da curva padrão com BSA para quantificação de proteínas pelo método de Bradford


Suplemento

Preparo do Reagente de Bradford e do BSA

Inicialmente, pesar 0,05 g do corante azul de Coomassie Brilliant Blue G-250 e dissolver em 25 mL de etanol 95%, agitando até completa dissolução. Em seguida adicionar 50 mL de ácido ortofosfórico 85%, e completar o volume para 500 mL com água destilada. Filtrar a solução duas vezes em filtro de papel.

Para a preparação da solução estoque de BSA (1 mg.mL-1, ou 1 µg.µl-1), pesar 1 mg de BSA e dissolver em 1mL de água destilada.


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