Introdução
Fatores como deficiência hídrica, variações de luminosidade e temperatura, salinidade, injúrias provocadas por patógenos, entre outros, podem intensificar a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) aumentando sua concentração no meio celular. Um dos mecanismos de proteção que a célula dispõe é a ativação de enzimas antioxidativas, dentre elas a superóxido dismutase e catalase. A enzima superóxido dismutase (SOD) catalisa a dismutação de radicais superóxido a peróxido de hidrogênio e oxigênio e podem ser detectadas três classes: cobre/zinco (Cu/Zn SOD), ferro (Fe-SOD) e manganês (Mn-SOD). A catalase (CAT), por sua vez, decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) gerado nos peroxissomos durante a fotorrespiração, bem como o produto de reação da SOD. A análise destas proteínas permite estudos para sua identificação e regulação na fisiologia de espécies vegetais, para proteção contra danos oxidativos induzidos por fatores de estresse.
Objetivos específicos desta prática
Elaborar mini-gel através do sistema de eletroforese em gel não desnaturante;
Identificar isoformas das enzimas superóxido dismutase e catalase por eletroforese;
Procedimentos
Análise da SOD em PAGE
Processar as amostras para obtenção do extrato (Figura 1), que será obtido através da maceração do material vegetal (na proporção de 1g de tecido vegetal para 3 mL de tampão de extração) utilizando nitrogênio líquido. Na sequencia, se adiciona o tampão de extração (tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 7.5), suplementado com 4% de PVPP. O homogeneizado deve ser centrifugado à 10.000 rpm por 30 minutos à 4ºC e o sobrenadante coletado, dividido em alíquotas e congelado à –80ºC, sendo utilizado para os ensaios das atividades enzimáticas, enquanto se descarta o precipitado.
Figura 1. Procedimento do material vegetal para obtenção do extrato bruto
Para o preparo do gel nativo, a concentração de acrilamida do gel separador depende do peso molecular dos componentes que se deseja analisar. Na literatura usam-se géis na faixa de 7,5 a 10%, essa variação é possível variando a concentração de acrilamida no gel, para um mesmo volume de solução, ou seja, basta alterar o volume da solução-estoque de acrilamida-Bis em relação ao da água; as quantidades dos demais componentes do gel permanecem inalteradas. Para identificação das isoformas ativas de SOD determinada em gel não desnaturante (PAGE), deve-se inicialmente ser confeccionado um gel de eletroforese (12%) (vide prática 45), sem a adição de SDS ao tampão inferior e superior.
Antes do preparo da amostra para aplicação no gel, deve ser realizado a quantificação de proteínas (Figura 2) para posteriormente misturar 2 volumes do extrato proteico (proteína solúvel) com 1 volume de tampão de amostra (glicerol com azul de bromofenol). A corrida indicada é de 180 mA, com voltagem constante, a 4ºC durante 90 min (aproximadamente).
Figura 2. Esquema de quantificação, preparo e corrida do gel a 4ºC
Para analisar a SOD, deve-se seguir os seguintes procedimentos: (i) Incubar o gel de poliacrilamida em solução reveladora contendo 50 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,8, 1 mM EDTA, 0,05 mM riboflavina, 0,1 mM nitrobluetetrazólio (NBT) e 0,3 % de TEMED. Ao final de 30 minutos, o gel deve ser lavado em água deionizada e exposto à luz até o aparecimento das bandas para que ocorra a foto-oxidação. Após essa etapa, a reação deve ser interrompida mergulhando-se o gel em solução de ácido acético (7%) por 15 minutos (Figura 3).
Figura 3. Esquema de revelação da SOD
(ii) Em um novo gel para caracterização das isoformas, com uma única canaleta além da canaleta para o padrão, deve-se aplicar 100 μg de extrato proteico e 10 μL do padrão da SOD. O gel deve ser dividido verticalmente em três partes iguais, as quais serão distribuídas em diferentes soluções: a primeira parte deve ser mantida a 4ºC em tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 7,8; a segunda parte deve ser imersa em tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 7,8 contendo 2 mM de KCN e 1,27 mM de EDTA; Por fim, a terceira parte mantida em tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 7,8 contendo 5 mM de H2O2 e 1,27 mM de EDTA. Todos os passos descritos devem ser realizados no escuro, ou seja, os recipientes contendo as soluções devem ser envolvidos com papel alumínio. Após 20 minutos, os géis devem ser submetidos à revelação com NBT e riboflavina (solução reveladora).
Análise da CAT em PAGE
Para analisar a SOD, deve-se seguir os seguintes procedimentos: (i) a eletroforese em PAGE não desnaturante deve ser realizada nas mesmas condições descritas acima para SOD. Para cada gel, deve-se aplicar amostras de padrão de CAT de fígado bovino – Sigma® (2 unidades) e 20 µg de proteínas da amostra que será analisada. A revelação deve ser realizada após a lavagem do gel por 45 minutos em água deionizada (3x 15min) e a incubação do mesmo por 10 minutos em 0,03% de H2O2 (pipetar 0,1 mL de H2O2 (30 vol) e misturar em 99,9 mL) de H2O2), à temperatura ambiente, com agitação suave e constante. Após esse período o gel deve ser rapidamente lavado em água deionizada e colocado por 10 minutos em solução corante (FeCl3 1% e K3Fe(CN)6 1%), sempre com agitação suave até que as manchas fiquem visíveis (Figura 1 D). Parar a reação com lavagem em água bidestilada.
Resultados esperados
As plantas apresentam diferentes fenótipos e padrões de expressão dos genes. A redução ou incremento da expressão de cada gene resulta na produção de diferentes sinais de isoformas, que podem ser caracterizadas por sua localização subcelular: peroxissomal, mitocondrial ou cloroplástidica. A realização da caracterização de isoformas deve ajudar na identificação dessas isoformas e na caracterização do nível de estresse nas plantas, conforme pode ser visualizado na figura 4. Portanto, com a realização dessa prática, espera-se conseguir a visualização do padrão de bandas que caracterizem as isoformas das enzimas antioxidativas citadas.
Figura 4. Gel de revelação de SOD e CAT, respectivamente. Padrão de SOD bovino (P)
A figura 5 apresenta um esquema didático de fácil visualização do processo com um todo.
Figura 5. Atividade de SOD e CAT e em PAGE não desnaturante
As setas indicam as respectivas isoformas identificadas em PAGE. 1- Extração de proteínas totais; 2- Quantificação e determinação do conteúdo de proteínas totais de acordo com Bradford; 3- Preparo de gel não desnaturante; 4a- Obtenção de géis de SOD e caracterização das isoformas conforme tratamento em KCN e H2O2; 4b- Obtenção de gel de CAT. Padrão de SOD bovino (P).
Suplemento
Solução para revelação de gel de SOD
Devem-se preparar as soluções separadamente em dois recipientes (devidamente cobertos com alumínio). Essa quantidade dá para revelar dois géis.
Recipiente A:
0,03 g EDTA
330 μL TEMED
0,02 g NBT
70 mL de tampão fosfato 7,8 (100 mM)
Recipiente B:
0,005 g de riboflavina
100 mL de H2O destilada
OBS.: Preparo da solução de revelação na proporção de 70 mL de solução A + 30 mL de solução B (manter no escuro). Misturar bem e dividir a solução de revelação em dois potes com 50 mL cada, nos quais serão colocados os géis no período de 30 min para reação.
Solução de KCN
0,0472 g de EDTA
0,013 KCN
100 mL de tampão fostato de potássio 100 mM (pH 7,8)
Solução de H2O2:
0,0472 g EDTA
70 μL de H2O2
100 mL de tampão fostato de potássio 100 mM (pH 7,8)
Tampão de coloração para CAT (200 mL)
Solução de 1% de FeCl3: 1 g/100 mL de água bidestilada
Solução de 2% de K3Fe(CN)6: 1 g/100 mL de água bidestilada
OBS.: Misturar as soluções no momento em que for utilizá-las e aferir volume
