Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 9 – DIAGNOSE DE DEFICIÊNCIA DE NITROGÊNIO EM PLANTAS DE MILHO

Introdução

O nitrogênio é um elemento essencial aos vegetais, requerido pelas plantas em grande quantidade, e por isto é classificado como macronutriente. Além de fazer parte da estrutura dos aminoácidos, proteínas, bases nitrogenadas, ácidos nucléicos, enzimas, coenzimas, vitaminas, clorofila e alguns compostos do metabolismo secundário, participa de processos como absorção iônica, fotossíntese, respiração, multiplicação e diferenciação celular.

As plantas cultivadas em solo ou em qualquer outro meio de cultivo com defici­ência de nitrogênio, apresentam uma série de sintomas de deficiência nutricionais. Alguns destes sintomas são perceptíveis visualmente e outros podem ser diagnosticados apenas química ou bioquimicamente. A deficiência de nitrogênio reduz o teor de clorofila no vegetal, resultando em uma clorose generalizada. Assim, a análise de tecidos vegetais é uma ferramenta de grande importância no estudo da nutrição mineral das plantas. Por meio da análise foliar é possível avaliar o estado nutricional das plantas e a partir dos valores encontrados, identificar possíveis sintomas de deficiências e toxidez, além de possibilitar a recomendação de adubação.


Objetivo específico desta prática

Avaliar o crescimento e caracterizar a sintomatologia da deficiência de nitrogê­nio em plantas de milho cultivadas em sistema hidropônico.


Procedimentos

Primeiramente deve-se lavar muito bem a areia, pelo menos cinco vezes, em água de torneira. Depois, deixar por 24h em solução de ácido clorídrico HCl a 5% e em seguida lavar novamente com água destilada, pelo menos cinco vezes ou até que o pH se eleve para valores superiores a pH 6.

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Figura 1: Procedimento sequencial para a lavagem da areia e neutralização do pH

Após o preparo do substrato, devemos cultivar as plantas. Para isso, temos que obter cerca de 50 sementes de milho (Zea mays L.) de boa qualidade. As sementes podem ser germinadas em bandejas de plástico, contendo areia lavada. Após a germinação, as plantas são transferidas para os vasos definitivos composto por vasos plásticos com capacidade para 5 litros, preenchido com areia lavada (substrato), tendo o mesmo um dreno em sua parte inferior para drenagem do lixiviado (Figura 2).

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Figura 2: Vaso preenchido com areia lavada, contendo um dreno na extremidade inferior

Para avaliação do efeito do nitrogênio nas plantas, os tratamentos devem constar da aplicação da solução nutritiva de Hoagland & Arnon modificada por Epstein & Bloom (2006) deficiente em nitrogênio e completa, com pelo menos quatro repetições. As soluções nutritivas completa e deficiente em nitrogênio devem ser preparadas conforme Tabela 1.

Tabela 1. Solução nutritiva de Hoagland & Arnon modificada por Epstein & Bloom (2006)

aula-900 (*) Solução de Fe-EDTA. Pesar 38,5 g de Fe-EDTA, dissolver em água destilada e completar o volume para um litro. A solução de ferro também pode ser preparada dissolvendo-se 26,1 g de EDTA em 286 mL de NaOH (1,0 M) e 24,9 g de FeSO4.7H2O.                                                                          (**) Solução de Micronutrientes. Para 1 L de solução, dissolver 2,86 g de H3BO3; 1,81 g de MnCl2.4H2O; 0,22 g de ZnSO4.7H2O; 0,08 g de CuSO4.5H2O e 0,02 g de H2MoO4.H2O. Após, completar o volume com água destilada para 1 L.

As soluções nutritivas devem ter seu pH controlado com auxílio do medidor manual de pH (Figura 3).

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Figura 3: Medição do pH da solução nutritiva

O valor de pH deve ser entre 5,5 e 6,5. Caso o pH estiver muito alcalino, adicione algumas gotas de HCl diluído; da mesma forma que se estiver ácido deve-se adicionar algumas gotas de NaOH diluído.

As plantas devem ser fertirrigadas diariamente com a aplicação gradual de 200 até 400 mL da solução de Hoagland, conforme necessidade da planta e tratamento. Aspectos fitossanitários, como a ocorrência de pragas e doenças, devem ser observados e controlados quando necessário. Visando atender aos objetivos dessa prática as plantas deverão ser colhidas aos 30 dias após a germinação.

Aos 30 dias de cultivo, o experimento deve ser paralisado e as plantas devem ser colhidas e avaliadas conforme descrito na Aula 8.

Avaliaremos também o teor de nitrogênio total nas amostras. Para tanto, a parte aérea e radicular das plantas devem ser secas em estufa regulada a 65°C por cerca de 72 horas (Figura 4a).

Na sequência, o material deve ser moído em moinho de facas de aço inoxidável (tipo Willey), com peneira de 2 mm (Figura 4b) e acondicionado em sacos de plásticos identificados (Figura 4c).

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Figura 4: Secagem, moagem e armazenagem das amostras da parte aérea e radicular dos tratamentos

Para a digestão sulfúrica dos materiais, pese 100 mg de cada amostra vegetal e transfira para um tubo digestor, adicionando sobre as amostras 7 mL da solução de digestão.

Na sequência, adapte o tubo ao bloco digestor (Figura 5) localizado na capela de exaustão e aqueça os tubos conforme a sequência: 80ºC, 100ºC, 200ºC e 300ºC, sendo uma hora em cada temperatura.

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Figura 5: Bloco digestor contendo amostras em tubos digestores

Na sequência, ligar o destilador de Kjeldahl e deixar pronto para funcionamento, conforme recomendação do fabricante. Em seguida, deixar os tubos esfriarem, dissolver o digerido com cerca de 10 mL de água destilada, acoplar o tubo digestor ao destilador de Kjeldahl e proceder a destilação com o auxílio de 25 mL de NaOH (50%). Recolher o destilado em um frasco tipo erlenmeyer contendo 10 mL de ácido bórico com indicador misto. Após obter 20 mL de destilado, toda a amônia deve ter sido destilada;

Para titular a amônia, vamos usar uma solução padrão de H2SO4 0,025 M. Para a mistura de indicador utilizada, o ponto final da titulação corresponde à mudança de cor: de verde para vermelho claro. Na sequência, proceder aos cálculos expressando o teor de N-total em mg g-1.

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Figura 6: Destilação do Nitrogênio (a esquerda) e titulação da amônia (a direita)

OBS.: Para calcular o teor de N-total na amostra, considerar que 1,0 mL do ácido sulfúrico 0,025 M gasto na titulação corresponde a 0,7 mg de nitrogênio na amostra.


Resultados esperados

Devem ser observados sintomas visuais característicos de deficiência foliar de nitrogênio e comparadas com plantas sem deficiências.

As plantas de milho submetidas à fertilização de Hoagland frequentemente exibem em suas folhas clorose longitudinal da nervura principal (Figura 7a), enquanto que as plantas cultivadas com a solução completa mantêm suas folhas com o verde intenso (Figura 7b).

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Figura 7: Folhas de plantas de milho cultivadas com solução nutritiva de Hoagland deficiente em N (A) e em solução completa (B)


Apêndice – Preparo dos reagentes
a. Mistura digestora

Num bequer, contendo cerca de 180 mL de água destilada, acrescenter 3,6 g de selenito de sódio (Na2SeO3) ou 5,47 g de Na2SeO3.5H2O na sua forma pentahidratada. Em seguida, acrescente 4,0 g de CuSO4.5H2O e mais 21,3 g de Na2SO4 ou 48,5 g de Na2SO4.10H2O. Com o auxílio de um bastão de vidro, dissolver os sais e acrescentar lentamente 200 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado (36 M).

b. Solução de ácido bórico mais indicador misto

Dissolver 20 g de ácido bórico em 1 L de água destilada e acrescentar 15 mL de uma solução alcoólica a 0,1% de verde de bromocresol e 6 mL de solução alcoólica de vermelho de metila a 0,1%.

c. Solução de ácido sulfúrico (0,025 M)

Em um balão volumétrico de 1000 mL, adicionar cerca de 500 mL de água destilada e acrescentar 1,4 mL de ácido sulfúrico concentrado (36 M). Na sequência, complete o volume para 1 L com água destilada e padronizar a solução.


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