Práticas Laboratorias em Biologia Vegetal

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AULA 43 – EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS VEGETAIS TOTAIS PELO MÉTODO TCA/ACETONA

Introdução

A extração de proteínas totais é uma etapa fundamental para a análise do perfil protéico de espécies vegetais. O método escolhido influencia diretamente as etapas posteriores como separação, resolução e identificação das proteínas. A obtenção de perfil eletroforético de boa qualidade exige que o método utilizado isole o máximo número de proteínas de uma dada célula, tecido, órgão ou organismo, mesmo em amostras recalcitrantes, além de remover contaminantes de forma eficiente. O método baseado na associação do ácido tricloroacético (TCA) com acetona possibilita uma extração rápida, com baixo custo, alto rendimento e produção de extrato protéico com alta qualidade e menor teor de contaminação por compostos fenólicos, típicos de plantas recalcitrantes.


Objetivos específicos desta prática

Coleta de diferentes órgãos vegetais (folhas e raízes);

Extração de proteínas solúveis totais pelo método TCA/acetona modificado;

Avaliação da qualidade da extração através da vizualização em gel de poliacrilamida 12,5%.


Procedimentos

Inicialmente selecione uma espécie vegetal, colete e pese em balança analítica 1 g do material vegetal (Figura 1a). Sugere-se coletar: (i) Folhas jovens, (ii) Folhas de planta adulta, (iii) Raiz de planta jovem ou (iv) Raiz de planta adulta. Na sequência, transfira o material coletado para almofariz autoclavado e resfriado e, em seguida, macere em nitrogênio líquido com o auxílio de pistilo também autoclavado e resfriado previamente (Figura 1B e 1C).

Fig_1.jpg

Figura 1. Processo de pulverização do material vegetal. A- Pesagem das amostras em balança analítica; B- Transferência para cadinho autoclavado e resfriado e C- Maceração em nitrogênio líquido

Ao macerado adicionar 5 mL de tampão de extração contendo TCA e transferir a mistura para tubo de polipropileno (tipo Falcon) de 15 mL, previamente resfriado em gelo (Figura 2).

Fig_2.jpg

Figura 2. Extração de proteínas totais. A- Adição do tampão de extração (TCA); B- Transferência do extrato protéico bruto para tubos de 15 mL; C-Aspecto geral da amostra

Para a precipitação e limpeza, as amostras devem ser agitadas em agitador de tubos do tipo vortex por aproximadamente 30 segundos e, então, centrifugar por 15 min a 13000 rpm e 15°C. Em seguida descarte o sobrenadante (fase superior) e adicione ao pellet (proteína precipitada) 5 mL de acetona 80% gelada misturando por inversão (Figura 3).

Fig_3.jpg

Figura 3. Etapas de precipitação e limpeza de proteínas totais vegetais, agitação, centrifugação, descarte do sobrenadante e aspecto geral do pellet após lavagem em acetona

O pellet deve então ser seco em freezer -20 °C (com o tubo sem a tampa) durante 1 hora. Em seguida adicionar 500 mL de tampão de ressuspensão e, com auxílio da pipeta, solubilizar lentamente o pellet. Transferir a amostra para microtubo de 1,5 mL. Aplica, então, 20 mL do extrato proteico em gel SDS-PAGE 12,5% acompanhado de marcador de peso molecular. Ao final do experimento analisa o perfil protéico obtido e compare com os perfis obtidos nos demais grupos.


Resultados esperados

Fig_4.jpg

Figura 4. Visualização do perfil proteico. MM- Marcador de peso molecular; 1- Folhas de plantas jovens, 2- Folhas de plantas maduras, 3- Raízes de plantas jovens e 4- Raízes de plantas maduras

Conforme observado na figura 4 o tecido escolhido e o estádio de desenvolvimento irão influenciar no perfil proteico observado no gel. Os extratos proteicos de folhas apresentam uma padrão mais evidente e definido uma vez que as folhas sofrem menos danos em comparação com as raízes. As raízes jovens apresentam, ainda, uma quantidade de proteínas intactas em comparação com as raízes de plantas maduras que ao longo do tempo são expostas a danos severos devido ao contato direto com o solo.

Apesar do padrão eletroforético da amostra 4 (raízes maduras) parecer mais claro e limpo é importante observar que isto ocorre por esta amostra conter uma menor concentração de proteínas intactas. Trabalhos envolvendo este tipo de amostra deve partir da extração de proteínas de uma maior quantidade de tecido vegetal para obter uma concentração de proteínas próxima as amostras oriundas de tecidos jovens e saudáveis.

A figura 5 apresenta um esquema didático de fácil visualização do processo com um todo.

LIVRFO.png

Figura 5. Esquema resumido do processo de extração de proteínas totais de plantas. 1- Coleta do material vegetal; 2- Pesagem em balança analítica; 3- Maceração em Nitrogênio líquido; 4- Adição do tampão de extração (TCA); 5- Transferência do macerado para tubos de 1,5 mL; 6-Aspecto geral da amostra; 7- Vortexação da amostra; 8-Cetrifugação; 9-Descarte do sobrenadante; 10-Lavagem do pellet em acetona 80% e 11- Aspecto do perfil proteico em gel SDS 12,5%


Suplemento

Tabela 1. Tampão de Extração sugeridotabela_1

Solução de Acetona 80%

     16 mL de Acetona PA

     4 mL de agua ultrapura

Tabela 2. Tampão de ressuspensão sugeridoTabela_2.jpg


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